[0051] 图2给出了用AT与BT切双谐振技术定量测定细胞牵引力与粘弹性参数及与荧光显微镜联用的示意图。AT切与BT切晶体为相同频率与表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子,在向两个池子加入了相同数目与质量的同一批细胞后,通过实时检测两晶体的频率变化后便可由式(Ⅰ)定量求出细胞的牵引力。当传感器表面修饰有细胞黏附分子RGD或fibronectin后,细胞-传感器的距离大为减少而可忽略,此时细胞层的平均存贮模量与损耗模量可由式(Ⅷ)与式(Ⅸ)分别定量求出。当细胞-传感器的距离不能忽略或不确定时,细胞的粘弹性可由式(Ⅹ)的细胞粘弹性指数半定量表征。本发明所提出的细胞牵引力与粘弹性的同时测定方法不需要显微镜,因此石英晶体表面所被金属电极及所修饰分子与材料不要求透明、可为任何材料、这是该方法的又一优势。具体地石英晶体表面可被有与细胞生物相容的金属金或非金属SiO2等。理想地,为获得伴随细胞牵引力与粘弹性变化的细胞形态与黏着斑、细胞骨架结构等动态信息,QCM晶体可与光学或荧光显微镜联用,此时需用到光透QCM电极,比如ITO电极。这样可进一步验证本发明方法,将细胞力学参数与细胞结构功能定量联系起来。
[0052] 所述细胞牵引力的实时与定量测定方法包括如下步骤:
[0053] (1)将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内,所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子;
[0054] (2)向培养皿或检测池中加入待测细胞,通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS:
[0055] ΔSt=(KAT-KBT)-l[tqATΔftAT/frAT-tqBTΔftBT/frBT]
[0056] 式中,ΔSt为细胞在粘附时间为t时的牵引力,KAT=2.75×10-l2cm2dyn-1,KBT=-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为给定晶体取向AT与BT切石英晶体的应力系数;frAT与frBT分别为AT BT
AT切与BT切石英晶体的谐振频率;tq 与tq 分别为AT切与BT切石英晶体的厚度,均为常数。ΔftAT,ΔftBT分别为AT切、BT切石英晶体在任意时间t相对于其参考点(在培养基中的稳定值)的频移。
[0057] 由表面应力ΔS引起的AT切与BT切晶体频移变化分别为:
[0058] Δf,sAT=frATKATΔS/tqAT
[0059] Δf,sBT=frBTKBTΔS/tqBT
[0060] (3)经在电极上修饰细胞黏附分子,如RGD或fibronectin而使细胞与传感器距离可忽略、细胞层厚度相对于声波探测深度为半无限粘弹性介质时,细胞层存储模量与损耗模量可按下面两式分别求出,
[0061] 细胞存储模量G′=π2Zq2(ΔR2/16π2Lq2-Δf2)/ρliqfr2
[0062] 细胞损耗模量G″=-πZq2ΔfΔR/2Lqρliqfr2
[0063] 式中Zq、Lq、fr分别为石英晶体的声阻抗、动态电感与谐振频率,为常数或可测定的常数。ρliq为培养基的密度、可看成水的宻度,亦为常数。Δf、ΔR为AT与BT切晶体所测得总的频移中扣除了表面应力部分引起频移之后的频移及动态电阻变化。本发明中作为一级近似,忽略了细胞表面应力或牵引力引起的动态电阻变化。
[0064] 本发明实验中采用的晶体频率为9MHz,此时tqAT=0.0185cm,tqBT=0.0282cm。因此(Ⅰ)式可简化为:
[0065] ΔSt=2.058×104(0.0185ΔftAT-0.0282ΔftBT)(dyne/cm) (Ⅺ)。
[0066] 细胞牵引力与细胞粘弹性同时定量测定实验
[0067] 修饰有特异性细胞黏附分子RGD或fibronectin的AT与BT切石英晶体同时定量测定细胞牵引力与细胞粘弹性的步骤如下:
[0068] (1)无水乙醇、Millipore清洗,氮气吹干AT与BT切9MHz晶体。
[0069] (2)滴加1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30%H2O2:H2SO4)于石英晶体金电极上处理30S,用Millipore水、无水乙醇清洗,氮气吹干,重复3次。将无水乙醇滴到电极上静置几分钟,灭菌水冲洗,氮气吹干。
[0070] (3)将表面处理好的AT与BT切石英晶体安装至Teflon井型池中。
[0071] (4)室温下向池中加入20mM的3-巯基丙酸与1mM的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚的混合无水乙醇溶液,避光静置过夜。
[0072] (5)取出溶液,用无菌水冲洗;加入溶有150mM EDC和30mM NHS的PBS缓冲溶液(pH=5.5),静置约30-60min。
[0073] (6)取出溶液,用PBS缓冲溶液(pH=5.5)、灭菌水冲洗;加入不同浓度的KRGD或fibronectin的PBS溶液,静置反应1-2h(RGDK)或过夜(fibronectin)。
[0074] (7)取出溶液,用灭菌后的PBS、无菌水冲洗,得到KRGD或fibronectin修饰的金电极。加入20,000人脐静脉内皮细胞,开启QCM进行监测。
[0075] (8)实验完毕,收集培养基,用PBS轻轻清洗,加入胰蛋白酶消化处理,对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
[0076] (9)细胞黏附过程细胞牵引力或表面应力的动态变化ΔS、细胞存储模量G′、细胞损耗模量G″、细胞粘弹性指数CVI分别据(XI)式、(Ⅷ)式、(IV)式、(X)式定量求出。
[0077] 药物blebbistatin与nocodazole验证试验步骤如下:
[0078] 按前述修饰RGD的AT与BT切石英晶体同时定量测定细胞牵引力与细胞粘弹性的步骤采用50μg/mL浓度的KRGD修饰9MHz AT与BT切晶体后,加入20,000人脐静脉内皮细胞,QCM检测黏附过程约17h后,分别向AT与BT切晶体检测池加入最终浓度为1.22μM的blebbistatin或0.5μM的nocodazole,继续监测约10或5小时,收集数据并求出细胞黏附过程及blebbistatin与nocodazole药物作用下细胞牵引力与粘弹性参数的变化规律。
[0079] 祼金电极AT与BT切石英晶体定量测定细胞牵引力与半定量测定细胞粘弹性及心血管激动药物异丙肾上腺素isoprenaline(ISO)和抑制药物维拉帕米verapamil(VRP)的影响实验步骤如下:
[0080] (1)取四个Teflon井型池,两个相同的9MHz AT切和两个相同的9MHz BT切被金电极晶体,将1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30%H2O2:H2SO4)滴到石英晶体金电极中央,处理约30s,然后用蒸馏水冲洗,氮气干燥,重复该步骤3次。
[0081] (2)将晶体组装于Teflon井型池。
[0082] (3)在用蒸馏水清洗池两次后,加约300μL灭菌水,置于37℃,5%.培养箱中。
[0083] (4)检查确定8通道QCM仪器QCA922有晶体谐振频率与动态电阻输出,依次连接检测池,确定每一检测池(如两个AT切、两个BT切晶体检测池)都工作,启动软件开始采集数据。
[0084] (5)待每一通道对应的数据稳定后,移除灭菌水,再用灭菌水清洗两次后用PBS清洗,后加入52μL含有胎牛血清的DMEM培养基,采集QCM谐振频率(f)与动态电阻(R)数据2h;再加入250μL含一定数量(如20000个)的H9C2大鼠心肌细胞的培养基后,连续采集f与R数据约20h。每一通道细胞黏附不同时间引起的QCM相对频移Δf与动态电阻变化ΔR以该通道在时间(t)时的QCM响应值减去其在培养基中的相应稳定值而求出。
[0085] (6)细胞在QCM电极上黏附约20h后,从四个池中分别取出5μL培养液,向其中的两个AT与BT切晶体检测池分别加入5μL 10μM ISO和5μL 2μM VRP,继续监测20h,收集数据。
[0086] (7)实验完毕,收集培养基,用PBS轻轻清洗,加入胰蛋白酶消化处理,对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
[0087] (8)按式(Ⅺ)与式(Ⅹ)求出细胞粘附过程及药物ISO与VRP作用下细胞牵引力与细胞粘弹性指数的动态变化ΔS与CVI。
[0088] 人脐静脉内皮细胞在KRGD与fibronectin修饰金电极上黏附伴随的细胞牵引力与粘弹性变化
[0089] 在9MHz AT与BT切石英晶体金电极上于不同KRGD浓度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL)下修饰QCM金电极晶体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的QCM响应及细胞牵引力与粘弹性变化规律如图3所示,在五种不同RGD表面密度修饰的金电极上,HUVECs的响应不同。通过QCM监测的频率、动态电阻的变化不同。AT切与BT切的频移响应曲线都表明在中等KRGD浓庋(50μg/mL)下修饰的石英晶体对细胞的黏附效果最好、频移最大(图3A与图
3B)。图3C的结果表明细胞牵引力ΔS为正,且随着时间增加、ΔS很快增大于8小时左右达到极值,之后有所降低。因此细胞在修饰有RGD分子的表面能很好铺展,细胞受到的为张应力得以铺展,ΔS为正。该结论与QCM频移响应结果及双谐振QCM技术理论一致。50μg/mL KRGD浓度下修饰的RGD表面的最后稳态牵引力(图3E),粘弹性参数,包括细胞存储模量(图3F、图
3G)与损耗模量(图3H、图3I),细胞粘弹性指数(图3J、图3K)均最大。因此可认为在该RGD表面密度下,细胞与RGD有很好的相互作用并使细胞得以顺利铺展,电极对HUVEC细胞的黏附效果最佳,该RGD浓度下细胞粘弹性指数也最大,表明细胞应力纤维量最多与最强,所搭建的细胞骨架结构最稳定、细胞最硬。这是目前为止首次实验证实了最佳细胞黏附对应最大细胞牵引力与最大细胞粘弹性。该结论得益于本发明对细胞黏附、细胞牵引力与细胞粘弹性的同时定量测定方法的突破。在裸金电极(0μg/mL RGD浓度)下,传感器的响应最小。细胞在较高浓度(75μg/mL和100μg/mL)RGD下修饰的RGD表面上所产生的QCM响应处于中间值,这可能是由于在较高RGD浓度下,细胞与传感器的相互作用由于RGD的取向受空间位阻影响较之对细胞具最佳黏附效果的50μg/mLRGD下有所减弱。
[0090] 我们也比较了不同fibronectin浓度(0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)下HUVEC细胞黏附过程的细胞牵引力(图4E)、细胞存贮模量(图4F)、细胞损耗模量(图4G)的动态变化结果,当fibronectin浓度为20μg/mL中间浓度时的稳态细胞牵引力、细胞存贮与损耗模量为最大。
[0091] 药物blebbistatin与nocodazole作用下的细胞力学性能变化
[0092] 为验证所建立的压电细胞力传感方法,我们采用50μg/ml RGD浓度下修饰石英晶体,考察了肌球蛋白II抑制剂blebbistatin作用下的QCM响应。图5表明在blebbistatin作用下,细胞牵引力ΔS下降;同时细胞粘弹性指数CVI下降、细胞存贮模量与损耗模量均降低、细胞变软。Blebbistatin是一种非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂,这里的结果与文献中其它方法报道的blebbistatin使细胞牵引力降低、细胞变软的结论是一致的。此外我们还考察了微管抑制剂nocodazole对细胞力学性能的影响,表明在0.5μM nocodazole作用下,细胞牵引力增加、细胞存储模量与损耗模量均增加、细胞变硬(图6),同样与文献中其它方法报道的主要结论一致。
[0093] 心血管激动药物异丙肾上腺素isoprenaline(ISO)和抑制药物维拉帕米verapamil(VRP)对细胞力学性能的影响
[0094] 图7给出了用裸金9MHz AT与BT切石英晶体检测大鼠H9C2心肌细胞黏附及随后受正性肌力药物ISO和负性肌力药物VRP作用下的动态QCM响应。由双谐振AT与BT切频移据式(Ⅺ)定量求出了细胞黏附过程及药物作用下细胞所施加给石英晶体表面应力或牵引力ΔS的动态变化(见图7E、F)。式(Ⅺ)结果表明如ΔS为负号时,细胞受到的是压应力(细胞收缩或正性肌力作用时),正号时受到的为张应力(细胞铺展或负性肌力作用时)。由于裸金电极对细胞的黏附能力有限,图7的结果显示ΔS稍大于为零,即细胞在裸金电极上只能有限地铺展。在正性肌力药物ISO作用下,细胞收缩更为加强、ΔS减小向负的方向变化(图7E),CVI增加(图7G、I)、细胞变硬。在负性肌力或舒张试剂VRP作用下,细胞变软(图7H、J)、舒张力增加(图7F)。这些结果表明双谐振QCM技术可望用于不同收缩、舒张试剂对细胞收缩与舒张功能的影响研究。