[0040] 由细胞内部、自身肌球蛋白产生的力一般都是由细胞边缘指向细胞中心,因此细胞牵引力又叫细胞内收缩力。图1给出了用AT与BT切双谐振技术定量测定细胞牵引力的两种构型。图1A中,AT切与BT切晶体处于两个不同的培养皿或检测池内,此时AT切与BT切晶体为相同频率与表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子,在向两个池子加入了相同数目与质量的同一批细胞后,通过实时检测两晶体的频率变化后便可由(1)式定量求出细胞的牵引力。图1B中,AT切与BT切晶体处于同一培养皿或检测池内,同样要求两晶体频率与表面形态一致和/或修饰相同的表面黏附分子,在向池子加入一定数目的细胞后,通过实时检测两晶体的频率变化后便可由(1)式定量求出细胞的牵引力。细胞牵引力的测定不需要显微镜,因此石英晶体表面所被金属电极及所修饰分子与材料不要求透明、可为任何材料、这是该方法的又一优势。具体地石英晶体表面可被有与细胞生物相容的金属金或非金属SiO2等。
[0041] 理想地,为获得伴随细胞牵引力变化的细胞形态与粘着斑等动态信息,QCM晶体可与光学或荧光显微镜联用,此时需用到光透QCM电极,比如ITO电极,同样可采用两种不同的构型,如图2A与2B所示。
[0042] 所述细胞牵引力的实时与定量测定方法包括如下步骤:
[0043] (1)将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内,所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子;
[0044] (2)向培养皿或检测池中加入待测细胞,通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS:ΔS=(KAT-KBT)-l[tqATΔfAT/frAT-tqBTΔfBT/frBT];
[0045] 式中,KAT=2.75×10-l2cm2dyn-1,KBT=-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数;frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率,tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度,均为常数。
[0046] 细胞牵引力双谐振技术实验
[0047] 祼金电极AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤如下:
[0048] 1)将1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30%H2O2:H2SO4)滴到石英晶体金电极中央,处理约30s,然后用蒸馏水冲洗,氮气干燥,重复该步骤3次。
[0049] 2)将晶体组装于Teflon井型池。
[0050] 3)在用蒸馏水清洗池两次后,加约300μL灭菌水,置于37℃,5%CO2培养箱中。
[0051] 4)检查确定8通道QCM仪器QCA922有晶体谐振频率与动态电阻输出,依次连接检测池,确定每一检测池(如两个AT切、两个BT切晶体检测池)都工作,启动软件开始采集数据。
[0052] 5)待每一通道对应的数据稳定后,移除灭菌水,再用灭菌水清洗两次后用PBS清洗,后加入52μL含有胎牛血清的DMEM培养基,采集QCM谐振频率(f)与动态电阻(R)数据2h;再加入250μL含一定数量(如20000个)的H9C2大鼠心肌细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养基后,连续采集f与R数据约20h。每一通道细胞粘附不同时间引起的QCM相对频移Δf与动态电阻变化ΔR以该通道在时间(t)时的QCM响应值减去其在培养基中的相应稳定值而求出。
[0053] 6)实验完毕,收集培养基,用PBS轻轻清洗,加入胰蛋白酶消化处理,对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
[0054] 7)细胞粘附过程细胞牵引力的动态变化ΔS可据相应成对AT与BT切石英晶体在时间t时的频移ΔftAT与ΔftBT由下式定量求出:
[0055] ΔSt=(KAT-KBT)-l[tqATΔftAT/frAT-tqBTΔftBT/frBT] (1)
[0056] 式中,ΔSt为细胞在粘附时间为t时的牵引力,KAT=2.75×10-l2cm2dyn-1,KBT=-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为给定晶体取向AT与BT切石英晶体的应力系数,为常数。frAT与frBT分别为AT切与BT切石英晶体的谐振频率;tqAT与tqBT分别为AT切与BT切石英晶体的厚度,两种切型的厚度与其频率之间的关系由各自的频率常数N决定,AT切与BT切石英晶体的频率常数分别为NAT=1.661MHz-mm与NBT=2.536MHz-mm。因此对于谐振频率fr确定的石英晶体,其厚度tq也就相应确定了,具体地:tqAT=1.661/frAT;tqBT=2.536/frBT。本发明实验中采用的晶体频率为9MHz,此时tqAT=0.0185cm,tqBT=0.0282cm。因此(1)式可简化为:
[0057] ΔSt=2.058×104(0.0185ΔftAT-0.0282ΔftBT)(dyne/cm) (2)
[0058] 修饰有特异性细胞黏附分子RGD与fibronectin的AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤如下:
[0059] 1)无水乙醇、Millipore清洗,氮气吹干AT与BT切9MHz晶体。
[0060] 2)滴加1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30%H2O2:H2SO4)于石英晶体金电极上处理30S,用Millipore水、无水乙醇清洗,氮气吹干,重复3次。将无水乙醇滴到电极上静置几分钟,灭菌水冲洗,氮气吹干。
[0061] 3)将表面处理好的AT与BT切石英晶体安装至Teflon井型池中。
[0062] 4)室温下向池中加入20mM的3-巯基丙酸与1mM的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚的混合无水乙醇溶液,避光静置过夜。
[0063] 5)取出溶液,用无菌水冲洗;加入溶有150mM EDC和30mM NHS的PBS缓冲溶液(pH=5.5),静置约30min。
[0064] 6)取出溶液,用PBS缓冲溶液(pH=5.5)、灭菌水冲洗;加入不同浓度的KRGD或fibronectin的PBS溶液,静置反应1-2h(RGDK)或过夜(fibronectin)。
[0065] 7)取出溶液,用灭菌后的PBS、无菌水冲洗,得到KRGD或fibronectin修饰的金电极。加入20,000HUVEC或H9C2细胞,开启QCM进行监测。
[0066] 8)实验完毕,收集培养基,用PBS轻轻清洗,加入胰蛋白酶消化处理,对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
[0067] 9)细胞粘附过程细胞牵引力的动态变化ΔS可据修饰有同样浓度的RGD或fibronectinAT与BT切石英晶体在时间t时的频移ΔftAT与ΔftBT由(2)式定量求出。
[0068] AT与BT切金电极表面修饰RGD多肽与fibronectin系通过在金电极表面经自组装修饰带有羧基的官能团及防止非特异性细胞粘附的PEG之后经化学耦合而实现。具体地,1)将经过Piranha溶液处理与乙醇清洗的AT切与BT切石英晶体金电极组装到Teflon井型池中,室温下向池中加入20mM的3-巯基丙酸与1mM的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚的混合无水乙醇溶液,避光静置过夜,取出溶液后,用无菌水冲洗;再继续加入溶有150mM EDC和30mM NHS的PBS缓冲溶液(pH=5.5),静置约30min后取出,PBS缓冲溶液(pH=5.5)、灭菌水冲洗;加入不同浓度的RGDK或fibronectin的PBS溶液,静置反应1-2h(RGDK)或过夜(fibronectin),分别用灭菌后的PBS、无菌水冲洗,取出溶液后得到KRGD或fibronectin修饰的金电极;之后直接加入20,000人脐静脉内皮细胞(HUVEC),开启QCM进行监测。
[0069] 心血管激动药物isoprenaline(ISO)和抑制药物verapamil(VRP)对细胞牵引力的影响实验步骤
[0070] 取四个Teflon井型池,两个相同的9MHz AT切和两个相同的9MHz BT切被金电极晶体,按前述祼金电极AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤,在四个池子中分别加入20,000个细胞,培养20h后,从四个池中分别取出5μL培养液,向其中的两个AT与BT切晶体检测池分别加入5μL 10μM ISO和5μL 2μM VRP,继续监测20h,收集数据。
[0071] 大鼠心肌细胞黏附过程及心血管肌力药物作用下细胞牵引力的动态变化[0072] 下面我们给出了用裸金9MHz AT与BT切石英晶体检测大鼠心肌H9C2细胞黏附及随后受正性肌力药物ISO和负性肌力药物VRP作用下的动态QCM响应,结果见图3。其中裸金电极是通过吸附DMEM中10%胎牛血清所含的贴壁因子而实现对H9C2细胞的非特异性黏附的。如图3A、C所示,随着ISO的加入,QCM上两种裸金电极AT切、BT切上的f(频率)均下降,R(动态电阻)均上升;在负性肌力药物VRP作用下的结果如图3B、D所示,随着VRP加入,QCM上f(频率)上升,R(动态电阻)下降,该结果与之前在AT切上的细胞黏附实验和药物实验趋势相吻合。此外,我们由双谐振AT与BT切频移据(2)式定量求出了细胞黏附过程及药物作用下细胞所施加给石英晶体表面应力或牵引力ΔS的动态变化(见图3E、F)。(2)式结果表明如ΔS为负号时,细胞施加的是压应力(细胞收缩或正性肌力作用时),正号时所施加的为张应力(细胞铺展或负性肌力作用时)。由于裸金电极对细胞的黏附能力有限,图3的结果显示ΔS为负,即细胞在裸金电极上主要以收缩状态存在,这与细胞牵引力实际上是内收缩力的结论是一致的。在正性肌力药物ISO作用下,细胞收缩更为加强。在负性肌力药物VRP作用下,细胞收缩减弱。
[0073] 人脐静脉内皮细胞在KRGD修饰金电极上黏附伴随的细胞牵引力变化[0074] 在9MHz AT与BT切石英晶体金电极上于不同KRGD浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)中修饰有不同表面密度细胞特异性黏附多肽RGD后在含2%胎牛血清的DMEM培养基中对20,000HUVECs细胞黏附阶段的QCM频移响应及其细胞牵引力动态变化如图4所示。AT切与BT切的频移响应曲线都表明在中等KRGD浓庋(50μg/mL)下修饰的石英晶体对细胞的黏附效果最好、频移最大(图4A与图4B)。图4C的结果表明细胞牵引力ΔS为正,且随着时间增加、ΔS很快增大到106dyne/cm,于8小时左右达到极值,之后有所降低。因此细胞在修饰有RGD分子的表面能很好铺展,细胞施加的为张应力,ΔS为正。与QCM频移响应结果一致,50μg/mL KRGD浓度下修饰的RGD表面给出最大的细胞牵引力,因此可认为在该RGD表面密度下,细胞与RGD有很好的相互作用并使细胞得以顺利铺展。细胞在较高浓度(100μg/mL)KRGD下修饰的RGD表面上所产生的牵引力最小,而该RGD浓度下QCM的频移响应处于中间值,这可能是由于在该RGD浓度下,细胞与传感器的相互作用由于RGD的取向受空间位阻影呴较之对细胞具最佳黏附效果的50μg/mL KRGD下有所减弱,可较25μg/mL KRGD浓度下还是要强很多,故频移处于中间值;但也正由于较强的细胞-传感器作用而可能影响了细胞铺展过程的细胞-细胞之间的作用而使细胞牵引力处于最小值。
[0075] 人脐静脉内皮细胞在fibronectin修饰金电极上黏附伴随的细胞牵引力变化[0076] 图5给出了9MHz AT与BT切石英晶体金电极于不同fibronectin(FN)浓度(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)中修饰有不同表面密度细胞外基质蛋白FN后在含2%胎牛血清的DMEM培养基中对20,000HUVECs细胞黏附过程的QCM频移与动态电阻响应及其细胞牵引力动态变化,此外也给出了裸金电极的结果对照。可见在没有修饰FN的裸金电极上黏附20,000HUVECs所引起的QCM频移与动态电阻变化最小,说明此时对细胞的黏附最弱,细胞不能很好铺展、主要处于收缩状态,细胞牵引力ΔS为负。但随着黏附时间的增加,电极表面可能从培养基中吸附有利于细胞黏附的贴壁因子及细胞本身分泌的细胞外基质因子,ΔS向正的方向变化、细胞得以逐渐铺展,最后接近低FN浓度下(10μg/mL)修饰金电极上细胞牵引力的值。金电衱上修饰了FN后,细胞牵引力ΔS为正值,表明细胞能很好铺展,对晶体施加引应力。比较这三种FN浓度下修饰金电极ΔS的响应(图5C),表明如同RGD下的情形,也是在中等浓度(20μg/mL)下ΔS为最大且较稳定,而此时的QCM频移与动态电阻响应也最大。在较低FN浓度(10μg/mL)下,细胞牵引力不仅最小,且随时间逐渐衰减,而相应的QCM频移与动态电阻变化响应也最小。高FN浓度(40μg/mL)下的QCM频移与动态电阻变化响应处于中间值,对应ΔS响应虽开始增加最快,但随时间变化有波动且呈现一定程度的衰减,因此最后稳定值反而低于中等浓度(20μg/mL)下的ΔS值。