[0042] 福氏完全佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0043] 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(MPEG-PLGA)购买自山东岱罡生物有限公司。
[0044] 其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
[0045] 本发明涉及到的各溶液如无特殊说明均指以下溶液，各溶液的制备方法为：
[0046] 碳酸盐缓冲溶液(0.05M，pH＝9.6，CB)：其作为包被缓冲溶液，称取1.59gNa2CO3，2.94gNaHCO3，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，主要用于包被抗原的稀释；
[0047] PBS溶液(0.01M，pH＝7.4)：称取8.0g NaCl，0.1g KCl，0.29g NaH2PO4·2H2O，2.96g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
[0048] PBST溶液(0.01M，pH＝7.4)：1000mL PBS缓冲液中加入500μL吐温-20。
[0049] 1wt％酪蛋白溶液：其作为封闭液，称取100mg酪蛋白溶解于10mL 0.01M，pH＝7.4的PBS中。
[0050] 底物液：称取1.02g柠檬酸，3.68g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解并定容到100mL。
[0051] 显色剂：称取0.0032g邻苯二胺溶于8mL上述底物液中，临用前再加入12μL30％的H2O2。
[0052] 终止液(2M硫酸溶液)：量取21.7mL浓硫酸加入到200mL二次水中，边加入边搅拌使其混合均匀。
[0053] 实施例1
[0054] 一种PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料的定量检测方法，包括以下步骤：
[0055] a、水解PSI-OAm-NAPI，将产物记为MFAP，得到水解后的MFAP溶液；
[0056] 将32mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到三口烧瓶并加热至60℃，加入1.6g聚琥珀酰亚胺(PSI)和1.63mL的油胺(OAm)，反应10min后加入0.83mL的N-(3-氨基丙基)咪唑(NAPI)，之后于100℃加热反应5小时，冷却至室温后加入180mL甲醇使其均匀沉淀，离心分离，取沉淀干燥。
[0057] 将质量为80mg的MFAP纳米粒子和0.8mg的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(MPEG-PLGA)溶解到1mL三氯甲烷溶液中，溶解后加入10mL浓度为0.006mg/mL氢氧化钠溶液，超声5min，功率约300W，将得到的溶液在55℃下蒸发除去三氯甲烷，之后于离心机20000r/min离心10min，取沉淀分散在2mL PBS缓冲液中，得到水解后的MFAP溶液，其浓度为
5mg/mL
[0058] b、制备MFAP包被抗原和免疫抗原，具体包括以下步骤：
[0059] b-1、在2mL水解后的MFAP溶液，加入包含0.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1.4mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC.HCl)的2mLPBS缓冲溶液，震荡反应20min后加入2mg牛血清白蛋白，于25℃下反应4h，之后于离心机12000r/min离心10min，取沉淀分散到1mLPBS缓冲液中，装入截留分子量为8000～140000Da的透析袋中，并用PBS缓冲液透析过夜，即可得到MFAP免疫抗原，其浓度为2mg/mL，收集保存于4℃冰箱待用。
[0060] b-2、与免疫抗原不同的为将所加牛血清白蛋白(BSA)替换为鸡卵清白蛋白(OVA)，其他试剂及剂量不变，所得产物即为MFAP包被抗原，其浓度为2mg/mL。
[0061] c、制备MFAP抗体
[0062] c-1、首次免疫：将步骤b得到的MFAP免疫抗原与弗氏佐剂1:1混匀，用注射器乳化1h后将乳化好的抗原通过背部皮下注射方式免疫新西兰大白兔。选取8只体重2kg左右，月龄2个月左右的健康雄性新西兰大白兔，其中1到6号兔子为实验兔，13、14号兔子空白对照组。用剪刀剪去兔子背部毛发，医用酒精消毒，背部皮下注射8到10个点，总剂量1.0mg/kg/次。三周后进行加强免疫；
[0063] c-2、加强免疫：将MFAP免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1.0mg/kg/次；此后每两周再进行一次加强免疫，在加强免疫中间周于兔耳缘静脉取血0.5mL，测效价，直到抗体效价达到1:64000，一周后心脏采血，纯化得到MFAP抗体，于-25℃保存待用。
[0064] 弗氏不完全佐剂的制备方法为：取50g无水羊毛脂和100mL液体石蜡进行超声混合，超声3h多次进行，每次20min，3小时后滴一滴乳化剂于冰水混合液中，若能够停留在水面上半分钟且不扩散则表示成功制备弗氏不完全佐剂。
[0065] d、间接竞争酶联免疫分析法定量测定MFAP
[0066] d-1、包被：将MFAP包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释成5μg/mL，包被96孔酶标板，以100μL/孔的量包被并于4℃冰箱内过夜；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min最后一次需拍干；
[0067] d-2、封闭：加入质量分数1％的酪蛋白封闭液，200μL/孔，37℃温育1.5h；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min最后一次需拍干；
[0068] d-3、加样竞争：每孔加入50μL浓度分别为0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、102ng/mL、103ng/mL、104ng/mL的MFAP标准液和50μL浓度为3μg/mL的MFAP抗体，37℃温育
2.5h；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min最后一次需拍干；
[0069] 不同浓度的MFAP标准液标准液的制备方法为：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液将PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料稀释到指定的浓度；
[0070] d-4、加酶：每孔加入100μL稀释比为1:5000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2h；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min最后一次需拍干；
[0071] d-5：显色:每孔加入100μL显色剂，于37℃显色30min；
[0072] d-6、终止：每孔加入50μL H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。
[0073] e、以MFAP标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，所得标准曲线的线性方程为：A＝0.951-0.104lgC，相关系数R＝-0.999，线性范围为0.82～6.31×104ng/mL，检出限为0.057ng/mL。
[0074] f、重复以上各步骤，只是将步骤c-3中的不同浓度的MFAP标准液替换为未知浓度的MFAP待测液，然后在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度值，求取平均吸光度值，根据上述标准曲线A＝0.951-0.104lgC，A为490nm处的吸光度值，C为MFAP的浓度，即可计算出待测MFAP的浓度。
[0075] 以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法，此方法所得到的标准曲线的线性关系最好，线性范围最宽。
[0076] 上述参照实施例对一种PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料的定量检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
