[0035] 本发明具体实施方式中识别性能评价按照下述方法进行:
[0036] 利用静态吸附实验完成,将10 mL一定浓度的OVA溶液加入到离心管中,加入一定量的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs),放在25℃恒温水域中静置若干小时,吸附后OVA含量用紫外可见分光光度计测定,并根据结果计算出吸附容量;饱和吸附后,选择几种其他蛋白质,作为竞争吸附物,参与研究TBA-MIPs聚合物的选择性识别性能;通过几种不同pH值下的吸附量,研究TBA-MIPs中性条下的吸附效果。
[0037] 下面结合具体实施实例和附图对本发明做进一步说明。
[0038] 实施例1:
[0039] (1)TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备:
[0040] 首先,对Fe3O4@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.1g 3-氨基苯硼酸与0.1g 1,6-己二胺分散在 20mL的乙醇中, 随后在30 ℃下搅拌30 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.025 g 核壳结构的Fe3O4@PGMA纳米颗粒并且在60℃ 回流12h,然后在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4@PGMA-TBA)。
[0041] (2)糖蛋白表面印迹聚合物的制备:
[0042] 首先,将0.005 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.025 g步骤(1)得到的 Fe3O4@PGMA-TBA加入到20 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中,超声分散5min,随后在暗处静置0.5h,让鸡蛋白蛋白与Fe3O4@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后,将Fe3O4@PGMA-TBA通过离心分离,并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白;将清洗干净的Fe3O4@PGMA-TBA重新分散在20 mL含有5 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中,在机械搅拌500 rpm下加入0.005 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物(TBA-MIPs);接着将得到的产物离心分离,并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质,再将产物在冰醋酸/水混合溶液(V/V, 1/9)中透析一周去除模板蛋白;最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。
[0043] 图1 为实施例 1中制备团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs)的示意图,首先3-氨基苯硼酸与1,6-己二胺自组装形成团队硼亲和分子(TBA),然后通过开环聚合将TBA分子固定,随后通过硼亲和作用在表面吸附模板蛋白,再通过苯胺的氧化聚合得到表面印迹层,洗脱模板后得到TBA-MIPs。
[0044] 图2为没有任何修饰的四氧化三铁(a)、四氧化三铁修饰上带环氧键的聚合物(b)和实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物TBA-MIPs(c)的TEM图,从图中明显的核壳结构可知修饰成功;图2中最右图是最终得到的TBA-MIPs的TEM图,从图中三层核-壳-壳结构可知印迹层约10-20 nm厚,印迹聚合物被成功制备。
[0045] 图3为实施例1中制备得到的Fe3O4@PGMA, Fe3O4@PGMA-TBA和TBA/MIPs的红外光谱图。对比可知,在Fe3O4@PGMA-TBA曲线中新出现在1381 cm-1 和 1652 cm-1处强的吸收峰,分别为B-O的伸缩振动和N-H的面内弯曲振动,表明TBA分子被成功引入Fe3O4@PGMA表面;而在TBA/MIPs曲线处出现的1158和 864 cm-1吸收峰为苯胺C-H的伸缩振动,表明成功形成印记层,印迹聚合物被成功制备。
[0046] 图4为实施例1中制备得到的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs)的XPS图,从图中可以观察到C 1s(283 eV),N 1s(398 eV),O 1s(530 eV),Si 2p (100 eV)和B 1s(189 eV),表面TBA分子被成功修饰到了粒子表面,并且所有元素表明TBA-MIPs被成功制备。
[0047] 实施例2:
[0048] (1)TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备:
[0049] 首先,对Fe3O4@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.167 g 3-氨基苯硼酸与0.138 g 1,6-己二胺分散在 40 mL的乙醇中, 随后在40 ℃下搅拌60 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.050 g 核壳结构的Fe3O4@PGMA纳米颗粒并且在60-100℃ 回流12h,然后在40-60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4@PGMA-TBA)。
[0050] (2)糖蛋白表面印迹聚合物的制备:
[0051] 首先,将0.010 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.050 g步骤(1)得到的Fe3O4@PGMA-TBA加入到30 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中,超声分散10 min,随后在暗处静置1 h,让鸡蛋白蛋白与Fe3O4@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后,将Fe3O4@PGMA-TBA通过离心分离,并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白;将清洗干净的Fe3O4@PGMA-TBA重新分散在30 mL含有10 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中,在机械搅拌600 rpm下加入0.010 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物(TBA-MIPs);接着将得到的产物离心分离,并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质,再将产物在冰醋酸/水混合溶液(V/V, 1/9)中透析一周去除模板蛋白;最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。
[0052] 实施例3:
[0053] (1)TBA修饰四氧化三铁纳米颗粒的制备:
[0054] 首先,对Fe3O4@PGMA纳米颗粒进行表面修饰。先将0.2 g 3-氨基苯硼酸与0.15 g 1,6-己二胺分散在 60 mL的乙醇中, 随后在60 ℃下搅拌390 min来形成B-N配位的团队硼亲和分子。然后加入0.075 g 核壳结构的Fe3O4@PGMA纳米颗粒并且在100℃ 回流12 h,然后在60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,得到TBA修饰的四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4@PGMA-TBA)。
[0055] (2)糖蛋白表面印迹聚合物的制备:
[0056] 首先,将0.015 g模板蛋白鸡蛋白蛋白和0.075 g步骤(1)得到的 Fe3O4@PGMA-TBA加入到40 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液中,超声分散15 min,随后在暗处静置1.5 h,让鸡蛋白蛋白与Fe3O4@PGMA-TBA表面的TBA分子通过硼亲和结合在一起。随后,将Fe3O4@PGMA-TBA通过离心分离,并且用去离子水清洗3遍除去表面非特性吸附的鸡蛋白蛋白;将清洗干净的Fe3O4@PGMA-TBA重新分散在40 mL含有15 uL苯胺的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中,在机械搅拌800 rpm下加入0.015 g的过硫酸铵引发苯胺氧化聚合得到表面印迹聚合物(TBA-MIPs);接着将得到的产物离心分离,并且用乙醇洗涤3次除去未反应物质,再将产物在冰醋酸/水混合溶液(V/V, 1/9)中透析一周去除模板蛋白;最后在40℃真空干燥TBA-MIPs直至质量恒定。
[0057] 实施例4:
[0058] 取10mL初始浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL的OVA溶液,OVA溶解在磷酸盐缓冲溶液中(20 mM, pH=7.4)加入到三组离心管中,一组离心管中分别加入10mg实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs)作为测试液,同样的,另一组离心管加入团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物(TBA-NIPs)作为对比,最后一组加入普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(APBA-MIPs)作为对比。将测试液和对比液放在25℃的水浴中静置50 min,离心机分离收集,未吸附的OVA分子浓度用紫外可见分光光度计测定,并根据结果计算出吸附容量。图 5 为试验例 1 中三种吸附剂的吸附容量及拟合图,结果表明,达到吸附平衡时团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs)的最大吸附容量是190.7 mg/g,并且符合 Langmuir模型,在相同温度下比非印迹聚合物 (TBA-NIPs)和普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(APBA-MIPs)要高,说明TBA-MIPs是一种有效识别和去除OVA的良好的吸附剂。
[0059] 实施例5:
[0060] 选择 pH 值6.0、7.4 、8.5作为影响测试值,用三种不同pH的缓冲溶液分别配置10 mL初始浓度为0.8 mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液于三离心管中,一组离心管中加入10 mg实施例1中制备的团队硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(TBA-MIPs)作为测试液,同样的,另一组离心管加入团队硼亲和糖蛋白表面非印迹聚合物(TBA-NIPs)作为对比,最后一组加入普通硼亲和糖蛋白表面印迹聚合物(APBA-MIPs)作为对比。
[0061] 把测试液放在25℃的水浴振荡器中,在50 min的时候取出;通过离心将印迹吸附剂和溶液分离开,滤液中的OVA浓度由紫外分光光度计在280 nm的波长下计算测定,并根据结果计算出吸附容量。
[0062] 图 6 为三种吸附剂吸附量受pH影响的结果图,结果表明,在酸性条件下三种吸附剂对于鸡蛋白蛋白的吸附效果都较差,说明酸性环境中硼酸并不能与糖蛋白产生较好的作用。而在中性条件下,TBA-MIPs相比于TBA-NIPs和APBA-MIPs都具有更加好的吸附效果,证明TBA-MIPs由于存在团队硼亲和分子具有更好的吸附效果。而碱性环境中,TBA-MIPs的吸附量也高于另外两种吸附剂,说明TBA-MIPs由于存在团队硼亲和配体以及表面印迹腔能够更加有利于糖蛋白进入印迹腔,尤其是在中性环境中拥有优于一般硼酸配体的吸附效果。
[0063] 实施例6:
[0064] 选择糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)、非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)为鸡蛋白蛋白(OVA)竞争吸附蛋白质,配置HRP、BSA、OVA的单组分溶液,三种物质的浓度都为0.8 mg/mL,pH为7.4。分别取10 mL配置好的溶液分别加入到三个离心管中,然后分别加入10 mg实施例1中的TBA-MIPs吸附剂,把测试液放在25℃的水浴中分别静置50 min,静置时间完成后,上层清液用高速离心分离收集,未吸附的各种竞争吸附蛋白质浓度用紫外分光光度计测定,结果表明,TBA-MIPs对HRP、BSA和OVA的吸附容量分别为190.7 mg/g,156.2mg/g和80.78 mg/g。图 7 为试验例 3中三种吸附剂对三种蛋白吸附容量选择性图,结果表明,TBA-MIPs对OVA有显著的专一识别性,吸附容量高于其它蛋白质。