[0050] 福氏完全佐剂、牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0051] 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(MPEG-PLGA)购买自山东岱罡生物有限公司。
[0052] 本发明中所有的透析袋,如无特殊说明,均指截留分子量为8000~14000Da的透析袋。
[0053] 其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
[0054] 本发明涉及到的各溶液如无特殊说明均指以下溶液,各溶液的制备方法为:
[0055] PBS缓冲溶液(0.01M,pH=7.4):称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H20 0.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL;
[0056] 洗涤液:为PBST溶液,在1000mL磷酸盐缓冲溶液(0.01M,pH=7.4,PBS)中加入500μL Tween-20,混合均匀;
[0057] 稀释液(0.01M,pH=7.1,PBS):称取NaCl 4.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H20 0.26g、Na2HPO4·12H2O 1.20g溶解于蒸馏水中并定容至500mL;
[0058] 碳酸盐缓冲液(0.5M,pH=9.6):称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至100mL;
[0059] 包被缓冲液CB(0.05M,pH=9.6):称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL;
[0060] 封闭液:称取1mg酪蛋白溶于1mL 0.01M,pH=7.4的PBS缓冲液中,混合均匀。
[0061] 实施例1
[0062] 一种基于痕量荧光免疫定量检测PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米药物载体的方法,所述方法包括以下步骤:
[0063] a、水解PSI-OAm-NAPI,得到水解后的MFAP溶液;
[0064] 取32mL N,N-二甲基甲酰胺并加热至60℃,之后加入1.6g聚琥珀酰亚胺(PSI)和1.63mL油胺(OAm),反应10min后加入0.83mLN-(3-氨基丙基)咪唑(NAPI),并将温度升至100℃反应5小时后冷却至室温,加入160mL甲醇在磁力搅拌下使其均匀沉淀,离心分离后取沉淀干燥,即可制得PSI-OAm-NAPI(MFAP);
[0065] 将质量为60mg的MFAP纳米粒子和0.6mg的(MPEG-PLGA)溶解到1mL三氯甲烷溶液中,溶解后将上述溶液加入到10mL浓度为0.006mg/mL的氢氧化钠溶液中,超声5min,功率约300W;之后磁力搅拌5min,在50℃下蒸发除去三氯甲烷,之后于12000r/min离心15min,取沉淀分散在2mL 0.01M,pH=7.4的PBS缓冲液中,得水解后的MFAP溶液,其浓度为5mg/mL[0066] b、制备MFAP的免疫抗原和包被抗原;
[0067] b-1、取1mL水解后的MFAP溶液中加入1mL PBS缓冲溶液中,该缓冲液包含0.1mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和0.7mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC.HCl),之后加入2mg牛血清白蛋白(BSA),25℃温育3h,之后于12000r/min离心15min,将得到的沉淀分散到1mL 0.01M,pH=7.4的PBS缓冲液中得MFAP免疫抗原溶液,装入透析袋中,用PBS缓冲溶液透析12小时以上,之后收集并于4℃低温保存,得到MFAP的免疫抗原,其浓度为2mg/mL;
[0068] b-2、包被抗原的制备与所述免疫抗原的制备基本相同,不同处在于将所用的大分子蛋白质牛血清白蛋白(BSA)改为鸡卵清白蛋白(OVA),其他条件均相同,其浓度为2mg/mL[0069] c、MFAP纳米药物载体高特异性抗体的制备;
[0070] c-1、首次免疫:选取8只体重2.5kg左右,月龄3个月左右的健康雄性新西兰大白兔,其中1到6号兔子为实验兔,13、14号兔子空白对照组。用剪刀剪去兔子背部毛发,医用酒精消毒,将MFAP的免疫抗原与福氏完全佐剂等体积比混合后,背部皮下多点注射到大白兔体内,注射8~12个点,注射量为1.0mg/kg/次;首次免疫三周后进行加强免疫;
[0071] c-2、加强免疫:将MFAP的免疫抗原与福氏不完全佐剂等体积比混合后,采取同样的方式注射到动物体内,注射量为1.0mg/kg/次;此后每两周再进行一次加强免疫,在加强免疫中间周从兔耳静脉取血1mL,测效价,直到抗体效价达到1:64000,一周后从颈动脉采血,室温静置1h,4℃静置3h后取上层澄清血清得到MFAP抗体,其浓度为13.5mg/mL。
[0072] 所述福氏不完全佐剂的制备方法为:将无水羊毛脂与液体石蜡以体积比1:2混合超声,即取50g无水羊毛脂和100mL液体石蜡,超声需多次进行,每次不超过20min,防止超声过程中温度过高,总超声3小时后取少量乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中,若能够以油滴状态停留在水面上且半分钟不扩散则是稳定的,即成功制备弗氏不完全佐剂。
[0073] d、FITC标记的MFAP荧光抗体的制备;
[0074] d-1、将1mL MFAP抗体经0.01M,pH=7.1的PBS缓冲溶液调整至抗体中蛋白浓度为20mg/mL,得到MFAP抗体溶液;
[0075] d-2、将异硫氰酸荧光素(FITC)溶于碳酸盐缓冲液中,制成浓度为2mg/mL的FITC溶液;
[0076] d-3、将步骤d-1和步骤d-2得到的溶液按体积比10:1混合,于25℃避光搅拌3~6h;
[0077] d-4、将步骤d-3得到的混合液装入透析袋中,于PBS溶液中透析4h后,采用凝胶过滤法纯化,即可得到FITC标记的MFAP荧光抗体。
[0078] d-4、将步骤d-3得到的混合液装入透析袋中,于0.01M,pH=7.4的PBS溶液中透析2~4h后,采用凝胶过滤法纯化,即可得到FITC标记的MFAP荧光抗体。
[0079] e、将MFAP包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中,封闭、加入不同浓度的MFAP标准品,以FITC标记的MFAP抗体作为一抗,建立直接竞争荧光免疫分析定量检测MFAP,具体为:
[0080] e-1、包被:用0.05M,pH=9.6的碳酸盐缓冲液稀释将MFAP包被抗原溶液稀释到33.3μg/mL,以每孔100μL的量包被96孔酶标板,于4℃温育12h;之后用洗涤液洗涤3次,每次
3分钟并甩干;
[0081] e-2、封闭:每孔加入200μL浓度为1%的酪蛋白封闭液,于37℃温育1h;之后用洗涤液洗涤3次,每次3分钟并甩干;
[0082] e-3、加样竞争:每孔加入50μL浓度分别为0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、2 3 4
10ng/mL、10ng/mL、10ng/mL的MFAP标准液和50μL荧光标记的MFAP抗体,37℃温育3h;之后用洗涤液洗涤3次,每次3分钟并甩干;
[0083] 不同浓度的MFAP标准液标准液的制备方法为:用0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液将PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料稀释到指定的浓度;
[0084] e-4、在酶标仪上测定各孔在激发波长为485nm,发射波长为528nm时的荧光强度。
[0085] f、以MFAP标准品浓度的对数为横坐标,荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线,从而定量检测出MFAP的浓度。所得标准曲线的线性方程为:A=7558.72-1365.50lgC,A为荧光强度,C为MFAP的浓度;相关系数R=-0.997,线性范围为0.48~1.19×104ng/mL,检检出限为0.090ng/mL。
[0086] g、重复以上各步骤,只是将步骤e-3中的不同浓度的MFAP标准液替换为未知浓度的MFAP待测液,然后在在酶标仪上测定各孔在激发波长为485nm,发射波长为528nm时的荧光强度,求取平均荧光强度值,根据上述标准曲线即可计算出MFAP待测液的浓度。
[0087] 以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法,此方法所得到的标准曲线的线性关系最好,线性范围最宽。
[0088] 上述参照实施例对一种基于痕量荧光免疫定量检测PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米药物载体的方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。