[0045] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0046] 本发明所使用的聚乙烯亚胺(PEI)购买自阿拉丁试剂公司，分子量10000，纯度99％。
[0047] 本发明所涉及的各物质的溶液，如无特殊说明，均为各物质的水溶液。
[0048] 实施例1
[0049] 一种对苯二酚的定量检测方法，包括以下步骤：
[0050] (1)将300μL、2.2g L‑1PEI的溶液与1.0mL pH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液混合，然后向混合液中加入700μL含有特定浓度对苯二酚的溶液，以使对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、
12.0、15.0μM，然后保持在60℃持续90分钟，在373nm的激发波长和5nm激发和发射狭缝下检测体系的荧光光谱，如图1、2所示，从中可以看出PEI没有荧光发射，但PEI和对苯二酚的混合物导致荧光强度增加，并且增加与对苯二酚浓度的增加有关；
[0051] (2)以0～2.5μM范围内的对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，如图3所示，所述标准曲线的线性方程为F＝104.5+1464.9C，其
2
线性相关系数R ＝0.996，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为对苯二酚的浓度，单位为μM，该方法的检测限为0.02μM，进而定量检测出对苯二酚的浓度。
[0052] 将步骤(1)检测体系进行透射电镜测试，透射电镜图如图4所示，从图中可以看出，对苯二酚与PEI反应之后得到了荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)，其在溶液中可以均匀分散，平均粒径约40‑60nm。
[0053] 图5为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和步骤(1)得到的荧光聚合物纳米颗粒‑1
(FPNs)的红外光谱(FTIR)光谱。PEI在1282至1595cm 处的峰值归因于N‑H弯曲振动，HQ在
‑1 ‑1 ‑1
1477cm 和800cm 处的峰值归因于C‑H弯曲振动。而FPNs的FTIR光谱中2935cm 处的峰值归
因于对称‑CH2伸缩振动，且在1561cm‑1处出现了HQ和PEI光谱中未出现的新峰，表明在交联期间PEI与HQ之间发生了交联，并且形成了亚胺键(C＝N)。由此可证明步骤(1)成功制备了
FPNs。
[0054] 图6为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的紫外‑可见吸收图。当仅存在FPNs时，在380nm处具有强特征吸收峰，而HQ和PEI在350nm以上没有显著吸收，新的吸收带可归因于C＝N键的n→π*跃迁。这些结果进一步表明FPNs的形成涉及在PEI存在下将对苯二酚氧化成对苯醌，然后发生席夫碱缩合。
[0055] 实施例2
[0056] 对苯二酚的定量检测方法中磷酸盐缓冲溶液的pH筛选
[0057] 在与实施例1同样的步骤下，在对苯二酚终浓度为1.0μM，测试加入不同pH的磷酸盐缓冲溶液时，体系的荧光光谱，进而以pH为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标作图，如图7所示，从图中可以看出，体系pH的大小会影响FPNs的荧光强度，pH在8.0‑10时，FPNs的荧光强度较大，在pH为8.2时，体系的荧光强度最大。因此在进行采用苯二酚的定量检测时，pH为8.2的磷酸缓冲溶液作为以后的实验条件。
[0058] 实施例3
[0059] 一种β‑葡萄糖苷酶活性的检测方法，包括以下步骤：
[0060] A、将100μL、1.0mMβ‑熊果苷溶液与100μL的pH＝6.5的40mM磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中分别加入500μL不同浓度的β‑葡萄糖苷酶溶液，以使体系中β‑葡萄糖苷酶的终浓度分别为0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、50、60、70、80、90、100U ‑1L ，然后在40℃下温育60分钟，得到水解液；
[0061] B、分别向步骤A得到的水解液中加入300μL、2.2g L‑1PEI溶液和1.0mLpH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液的混合溶液，将其在60℃孵育90分钟以形成FPNs，在此阶段，由于在
FPNs形成期间较高的pH和温度，β‑葡萄糖苷酶对β‑熊果苷的催化水解停止，使用Hitachi F‑4700荧光分光光度计在373nm的激发波长和5nm的激发和发射狭缝处检测体系的荧光光
谱，如图8所示；
[0062] C、以0～36U L‑1范围内的β‑葡萄糖苷酶的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建线性曲线，如图9所示，所述标准曲线的线性方程为F＝–57.8+116.6C，2
其线性相关系数R ＝0.994，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为β‑葡萄糖苷酶的浓度，单‑1
位为U L ，使用等式Clim＝3δ/k(其中δ是空白测定的标准偏差(n＝6)和k是校准曲线的斜‑1
率)确定的检测极限(Clim)为0.4U L 。进而定量检测出β‑葡萄糖苷酶的活性。
[0063] 图10为β‑葡萄糖苷酶、β‑葡萄糖苷酶和β‑熊果苷、HQ、β‑熊果苷的紫外光谱图，由图10可知β‑葡萄糖苷酶在250nm以上没有吸收峰，β‑熊果苷的紫外吸收在282nm处，而β‑葡萄糖苷酶催化β‑熊果苷水解的产物在290nm左右有明显的紫外吸收峰，这与纯HQ水溶液的紫外吸收完全一致。这表明β‑葡萄糖苷酶催化β‑熊果苷水解生成了HQ。
[0064] 本方法检测β‑葡萄糖苷酶示意图如图11所示。
[0065] 实施例4
[0066] β‑葡萄糖苷酶水解β‑熊果苷时磷酸盐缓冲液pH的筛选
[0067] 在与实施例2同样的步骤下，在β‑葡萄糖苷酶浓度为35U L‑1时，测时在β‑葡萄糖苷酶水解β‑熊果苷时，加入不同pH的磷酸盐缓冲溶液时，体系的荧光光谱，进而以pH为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标作图，如图12所示，从图中可以看出，体系pH的大小会影响β‑熊果苷的水解，从图12可以看出，pH在6.5‑7.0时，FPNs的荧光强度较大，在pH为6.5时，体系的荧光强度最大，因此本实验采用pH为6.5的磷酸缓冲溶液作为β‑葡萄糖苷酶水解β‑熊果苷时的实验条件。
[0068] 实施例5
[0069] β‑葡萄糖苷酶活性的检测的抗干扰实验
[0070] 一个稳定优良的荧光探针，必须有较好的选择性和抗干扰能力。通过测定由各种潜在干扰物质的存在引起的荧光强度来评估探针对β‑葡萄糖苷酶的选择性。因此，本发明选择了一系列干扰酶和生物蛋白，如α‑葡萄糖苷酶，过氧化氢酶，人血清蛋白，牛血红蛋白，牛血清白蛋白，鱼精蛋白，L‑半胱氨酸，谷胱甘肽和甘氨酸用于进行干扰性实验测试。上述‑1 ‑1
各物质在体系中的终浓度分别为：β‑葡萄糖苷酶20U L ，α‑葡萄糖苷酶200U L ，过氧化氢‑1 ‑1 ‑1 ‑1
酶200U L ，人血清蛋白10mg L ，牛血红蛋白10mg L ，牛血清白蛋白10mg L ，鱼精蛋白
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
10mg L ，L‑半胱氨酸10mg L ，谷胱甘肽10mg L 和甘氨酸10mg L 。
[0071] 如图13所示，由β‑葡萄糖苷酶(20U L‑1)引起的探针系统的荧光强度显着大于其他测试物质的荧光强度。这些结果表明该探针对β‑葡萄糖苷酶具有突出的特异性和选择性，而不受其他非靶标样品的干扰。
[0072] 实施例6
[0073] 实际样品中β‑葡萄糖苷酶浓度的测定
[0074] 为了说明所提出的传感器在实际样品中的实用性，在该测定中使用稀释的人血清白蛋白(0.5％)来监测实际样品中的β‑葡糖苷酶活性。用去离子水将人血清白蛋白样品(含有0.5％人血清白蛋白)稀释500倍。在0.5％人血清白蛋白样品中测量β‑葡糖苷酶活性。由于未检测到0.5％人血清白蛋白样品中的β‑葡萄糖苷酶，因此使用标准加入法计算β‑葡萄‑1
糖苷酶的回收率。其他程序与实施例3中β‑葡萄糖苷酶检测程序类似。加入10和20U L β‑葡萄糖苷酶的0.5％人血清白蛋白样品的回收率见表1。实际样品中β‑葡萄糖苷酶的平均回收率范围为95.2％～104.5％，相对标准偏差(RSD)低于2.9％。所有这些结果表明所提出的传感器可以用于生物基质中以进行β‑葡萄糖苷酶活性监测。结果如表1所示：
[0075] 表1 0.5％人血清白蛋白样品中β‑葡萄糖苷酶的分析
[0076]
[0077] 上述参照实施例对利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β‑葡萄糖苷酶的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
