一种RNA抑菌剂phasiRNA5及作物病菌抑制剂   0    0

[0001] 本发明涉及作物灰霉病菌的保护和治疗，具体涉及RNA抑菌剂phasiRNA5及一种作物病菌抑制剂。

[0002] 番茄(Solanum lycopersicum)是世界上仅次于马铃薯第二重要的茄科植物，在很多国家都有种植。番茄果实脂肪含量低、不含胆固醇、富含维生素A、抗坏血酸、钾和叶酸等营养成份；同时还含有大量非营养性化学物质，如胡萝卜素(番茄红素、八氢番茄红素和β‑胡萝卜素)和多酚，由于其营养的健康性而广泛受到大众的喜爱。番茄的大面积推广种植，各种番茄病害也随之流行甚至爆发；尤其是随着设施农业的发展，番茄的连茬重茬种植，各种病害在番茄生产过程中造成了严重的经济损失，尤其是一些真菌性病害，其中番茄灰霉病是近10年来成为危害番茄的主要病害之一，常导致番茄减产20％～40％，严重时可达60％以上。所以，番茄灰霉病的危害日趋严重，已成为保护地番茄产业发展的主要限制因素。

[0003] 引起番茄灰霉病的病原菌是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，属于葡萄孢属(Botrytis)半知菌类。该病原菌腐生性很强，寄主范围非常广泛，可侵染番茄、草莓、辣椒、葡萄等多种水果和蔬菜。番茄灰霉病通过气流传播，并且传播速度很快，使得该病在番茄的设施农业栽培过程中的防治非常困难。目前番茄灰霉病的防治还是主要依赖化学农药，如甲酰胺、嘧霉胺、乙霉威、多菌灵、腐霉利和甲基硫菌灵等。由于番茄灰霉病菌繁殖快、传播迅速和易变异等特性，伴随着大量杀菌剂的重复多年使用，番茄灰霉病菌逐渐对各种杀菌剂产生了抗药性，使得化学杀菌剂的防治效果大大降低。并且，随着人们生活水平的逐年提高，人类追求健康饮食的诉求也越来越高。番茄生产过程中大量化学杀菌剂的使用，农药生产和使用过程中对环境和水资源的污染等越来越受到人们的关注。因此迫切的需要一些替代性的防治措施去抵抗灰霉病，所以开发新的无公害、环保型的新型农药成为科学家们首要的研究目标。

[0004] phasiRNA(phase,secondary,small interfering RNA)是一类合成途径有别于其它siRNA的特殊siRNA，其由miRNA介导生成，首尾相连具有相位排列结构特征。根据作用方式的不同，可以将其分为两种，一种为顺式作用小干扰RNA(cis acting siRNA,ca‑siRNA)，ca‑siRNA作用于它的来源基因以及来源基因的同家族基因；另一种为反式作用小干扰RNA(trans acting siRNA,ta‑siRNA)，ta‑siRNA则通过碱基互补配对靶向并剪切其他基因的mRNA，其作用方式类似于miRNA。它与植物中其他的内源性小RNA一样，在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要的作用。

[0005] PhasiRNA由RNA聚合酶II(RNA polymerase II)从PHAS位点转录出初级转录本(primary PHAS transcript,pri‑PHAS)，随后THO/TREX(transcription/export)复合体将phasiRNA初级转录本从细胞核运转到细胞质中，在粗面内质网的多聚核糖体上对phasiRNA进行进一步的加工，phasiRNA前体与多聚核糖体结合后，随即暴露出部分phasiRNA前体，miRNA通过碱基互补配对与phasiRNA初级转录本上的特定位点结合，介导AGO蛋白切割生成phasiRNA前体(pre‑phasiRNA)；在SGS3(suppressor of gene silencing 3)和SDE5(silencing defective5)的协助下，RDR6(RNA‑dependent RNA polymerase 6)将单链RNA复制成双链RNA；最后双链RNA被DCL4(Dcer like 4)和DRB4(dsRNA‑binding protein 4)复合体切割成首尾相连的、相位小片段RNA，之后被HEN1(HUA ENCHANCER1)甲基化，甲基化后的小片段RNA就形成了phasiRNA。

[0006] 研究发现小RNA参与调节了复杂的植物‑‑‑病原菌的相互作用和病原菌侵入植物后的植物免疫应答反应。Koch等研究表明，在大麦叶片上喷施能同时靶向禾谷镰刀菌麦角甾醇合成的3个必需基因CYP51A，CYP51B和CYP51C的dsRNA，能显著防治大麦的赤霉病；在多种水果、蔬菜及花卉植物叶片上施用靶向灰霉病菌DcL1/2的dsRNA及siRNA均可有效抑制灰霉病菌的生长，达到病害防治的目的。进一步的研究表明，这些RNA分子是可移动的，在离体叶片上不仅施用小RNA部位的病原菌生长被抑制，同时发现在未直接施用小RNA部位的病原菌也可以被抑制，表明RNA分子可以直接被植物病原菌的细胞吸收，也可以在植物细胞内积累，同时也可以在不同物种或生物界中相互作用的生物之间转移。

[0007] 因此，这些靶向病原体基因的小RNA可以作为对植物病害有效防治的新一代杀菌剂。RNA农药研发的关键与化学农药研发相似，都是有效分子的筛选和活性探索，因此具有不同结构特征的小RNA分子的定向筛选对于有效利用SIGS进行病害防治尤为重要。纳米粒子技术的最新进展同时改善了SIGS在植物保护中的潜在应用。裸露的dsRNA和sRNA处理可以在喷洒后达10天之久保护植物免受微生物病原体的侵害。以上研宄表明，小RNA分子可以作为开发新型杀菌剂的研发方向用于植物病害的防治，减少目前农业生产过程中由于大量使用化学杀菌剂所带来的环境危害。

[0008] 本发明的一个目的在于提供一种RNA抑菌剂phasiRNA5，其具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列(UUUGAAAAAGAGGAUUCCGGG)。

[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种作物病菌抑制剂，所述抑制剂中至少包含phasiRNA5。

[0010] 本发明所述抑制剂可抑制的病菌至少包括灰霉菌，及其同属病菌。

[0011] 在某些实施例中，所述抑制剂为包含所述phasiRNA5的喷雾剂，通过喷雾来实现对灰霉病的有效预防和治疗。

[0012] 本发明的有益效果主要体现在：

[0013] 1、施加phasiRNA5的溶液能显著抑制灰霉菌孢子的萌发以及灰霉菌对植物的感染毒力，可用于蔬菜作物的灰霉病的防治。

[0014] 2、phasiRNA5为植物体内产生，安全可靠。

[0015] 3、基于SIGS技术防治作物病害的另一个优势在于RNA作为抑菌因子，具有环境友好、专一性强、抑菌效果良好等特性，是未来农药发展的主要方向之一。

[0019] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0020] 一、实验准备

[0021] (1)番茄phasiRNA5的发现

[0022] 利用sRNA组学及实时定量RT‑PCR验证，发现一个能够靶向灰霉病菌的编码基因的番茄内源性的小RNA，它与现在报道发现的所有番茄乃至所有的植物miRNA都没有同源性，但经phaseTank预测分析发现，该sRNA的前体能产生phasiRNA，因此我们将它定义为phasiRNA，命名为phasiR5。

[0023] (2)phasiRNA5药物的合成

[0024] 在吉玛基因公司(中国上海)合成了phasiRNA5药物。每管phasiRNA5药物1OD，按照说明书要求加入无RNA酶的ddH2O，phasiRNA5药物的最终浓度为10μM。

[0025] (3)番茄灰霉菌孢子的培养

[0026] 选取完整的无伤口的番茄，在超净工作台中用75％的无水乙醇反复擦洗5遍。如果番茄根部有蒂，最好把蒂去除。去除时注意不要造成伤口，伤口会使灰霉菌在培养的过程中容易污染。用灭过菌的手术刀在番茄上切出几个伤口，然后将灰霉菌块覆盖在番茄表面的伤口上。灰霉菌块是培养在固体PDA培养基上。将番茄放在架子上，然后置于盆中。放置前要将架子和盆用75％的无水乙醇多喷洒几遍，保证消毒彻底，可以减少灰霉菌培养过程中的污染。然后把灰霉菌放在22℃的潮湿的培养箱中进行培养。培养时一定要注意灰霉菌的保湿。2周后，番茄表面会长满灰霉菌菌丝及孢子，用作实验。采取灰霉菌孢子时，用刷子轻刷番茄的表面，溶于ddH2O。然后通过玻璃棉过滤得到灰霉菌的孢子。将过滤出来的灰霉菌孢6
子在无菌蒸馏水中洗涤两次。用细胞计数板进行计数，并调节至5×10 分生孢子/mL的浓度。用于实验中的生物测定。

[0027] 二、phasiRNA5对灰霉菌孢子萌发的影响

[0028] 用Bilir等人描述的方法来进行分生孢子的萌发实验。简单来说，就是将玻璃纸剪成大小为1.0cm X 1.0cm大小，然后在高压灭菌锅下，115℃，灭菌15min，备用。灭菌时，将剪好的玻璃纸放入无菌水中在放进灭菌锅。然后在超净工作台中，将玻璃纸置于无添加抗生素的1/2MS培养基上。然后用移液枪在玻璃纸上滴加5μL的分生孢子的悬浮液，同时加入5μL的phasiRNA药物(终浓度为：10uM)；

[0029] 对照组1以等量的NC RNA代替phasiRNA5药物，NC RNA是一条长度为21nt的RNA，但它不能靶向番茄和灰霉病菌的任何基因，也就是在番茄和灰霉病菌的RNA上没有结合位点。

[0030] 对照组2：以等量的miR1001代替phasiRNA5药物，miR1001是一条已报道对灰霉病菌生长及植物感染有抑制作用的番茄miRNA。

[0031] 将培养基放置于24℃的培养箱中进行培养。12h后在光照显微镜下观察分生孢子的萌发情况。结果如图1所示，phasiRNA5处理后绝大部分的灰霉菌孢子没有萌发，而未经phasiRNA5药物处理的对照组孢子萌发效率极高，长势良好；经miR1001处理的灰霉菌孢子虽有萌发，但萌发效率低，萌发后的菌丝生长慢。这些结果表明施加phasiRNA5对灰霉菌孢子的萌发具有明显的抑制效果。

[0032] 三、phasiRNA5对灰霉病菌孢子感染植物叶片的影响

[0033] 取上述浓度为5×106个/mL的孢子溶液5μL，加入phasiRNA5使终浓度达到10μM，混匀后将10μL的phasiRNA5‑孢子混合液滴加到离体的烟草叶片上；

[0034] 对照组1以等量的NC RNA代替phasiRNA5药物与孢子混合液后滴加到离体的烟草叶片上。

[0035] 对照组2：以等量的miR1001代替phasiRNA5药物与孢子混合液后滴加到离体的烟草叶片上。

[0036] 实验设3个重复。处理叶片在24℃光照培养箱中保温保湿培养3天后，对灰霉菌的侵染程度进行观测并拍照记录。并且进行了台盼蓝染色处理。侵染叶片时，为了方便拍照和后期的台盼蓝染色处理，我们会采用离体的番茄叶片及烟草叶片。培养时，要注意离体叶片的保湿。我们将离体叶片的根部用湿棉花包裹起来，培养期间小心地往棉花上喷无菌水。喷水时注意不要喷到植物叶片上，防止对实验结果造成影响。结果如图2所示，未经phasiRNA5处理，灰霉菌孢子在叶片上的病斑明显大于经miR1001处理的病斑,而miR001处理的病斑也明显大于phasiRNA5处理的病斑。经测量病斑直径，NC RNA处理的病斑平均直径约为17mm左右；miR001处理的病斑平均直径约为5mm，而经phasiRNA5处理的病斑平均直径非常小，小于2mm左右(图2)。这些结果表明，相比NC RNA和miR1001，施加phasiRNA5对灰霉病菌孢子侵染植物叶片的毒力抑制更好。

[0037] 四、phasiRNA5对灰霉菌菌丝侵染番茄叶片的抑制效果

[0038] 从PDA固体培养基上刮取约10mg灰霉菌菌丝，将其放置于植物的表面，然后往灰霉菌菌丝上添加5μL浓度为10μM的phasiRNA5药物，使药物完全覆盖灰霉菌的菌丝。

[0039] 对照组1中以等量的NC RNA代替phasiRNA5药物。

[0040] 对照组2：以等量的miR1001代替phasiRNA5药物。

[0041] 将上述处理好的样品放在24℃光照培养箱中保温保湿培养3天后，观察叶片菌斑大小。结果如图3所示，经phasiRNA5处理后，灰霉病菌孢子在叶片上的病斑明显小于经NC RNA处理的对照1和经miR1001处理的对照2上的病斑。测量病斑直径，对照1组叶片的病斑平均直径约为15mm；对照2的平均直径约为6mm；而经siR2处理的病斑直径小于3mm(图3)，也证实施加siR2对灰霉病菌菌丝的侵染毒力抑制效果好于NC RNA和phasiRNA5。

[0042] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

[0016] 图1为phasiRNA对灰霉病菌孢子萌发的抑制效果。

[0017] 图2phasiR5对灰霉病菌孢子侵染叶片的抑制效果(A)及病斑直径(B)。

[0018] 图3phasiR5对灰霉病菌菌丝侵染叶片的抑制效果(A)及病斑直径(B)。