[0029] 1.菌株的筛选纯化:
[0030] 以传统低温发酵的新鲜虾酱(来源于山东省威海市某一农家餐馆自制的虾酱)为原材料,从虾酱中分离筛选出产低温蛋白酶的动性球菌。将新鲜虾酱稀释涂布于固体培养基上,15℃培养48h,挑取具有典型特征的菌落,进行多次划线分离纯化,最后获得产低温蛋白酶的动性球菌单菌落。将分离纯化后的单菌落接种到斜面上,25℃培养24h,保藏备用。
[0031] 2.菌株的鉴定
[0032] 2.1形态学鉴定
[0033] 菌落呈橘黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明、菌落致密;革兰氏染色为阳性;菌体呈球状,单个或成堆排列(见图1、图3、图5和图7)。
[0034] 2.2生理特征
[0035] 4株动性球菌在NaCl浓度为0~15%时均可进行生长;在pH为7~9时,生长较快;在温度范围为15℃~35℃都能进行良好生长;
[0036] 2.3分子生物学鉴定
[0037] 对筛选纯化后的动性球菌进行16S rRNA测序,确定为Planococcus maritimus、Planococcus plakortidis、Planococcus dechangensis以及Planococcus rifietoensis,并构建生物进化关系树(见图2、图4、图6和图8)。
[0038] 3.菌株的保藏
[0039] 4株动性球菌均已经于2019年01月02日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2),该菌株已经于2019年01月02日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),编号为CGMCC NO.17057,建议的分类命名:Planococcus maritimus。
[0040] 普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10),该菌株已经于2019年01月02日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),编号为CGMCC NO.17058,建议的分类命名:Planococcus plakortidis。
[0041] 德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11),该菌株已经于2019年01月02日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),编号为CGMCC NO.17059,建议的分类命名:Planococcus dechangensis。
[0042] 莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12),该菌株已经于2019年01月02日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),编号为CGMCC NO.17060,建议的分类命名:莱比托游动球菌Planococcus rifietoensis。
[0043] 实施例1:
[0044] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0045] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐5%(w/w)混匀,备用。
[0046] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0047] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:1:1:1进行混合5
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0048] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度15℃下保温发酵5d。
[0049] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌10min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0050] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌30min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0051] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0052] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到0.974g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
113mg/100mL;组胺含量为17mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0053] 实施例2:
[0054] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0055] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐5%(w/w)混匀,备用。
[0056] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0057] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:2:2:1进行混合5
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0058] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度15℃下保温发酵30d。
[0059] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌10min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0060] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌30min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0061] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0062] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到1.327g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
125mg/100mL;组胺含量为23mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0063] 实施例3:
[0064] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0065] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐8%(w/w)混匀,备用。
[0066] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0067] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:2:1:1进行混合6
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0068] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度20℃下保温发酵10d。
[0069] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌15min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0070] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌15min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0071] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0072] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到1.034g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
119mg/100mL;组胺含量为20mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0073] 实施例4:
[0074] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0075] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐10%(w/w)混匀,备用。
[0076] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0077] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:2:1:2进行混合6
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0078] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度20℃下保温发酵15d。
[0079] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌15min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0080] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌15min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0081] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0082] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到1.116g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
108mg/100mL;组胺含量为19mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0083] 实施例5:
[0084] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0085] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐10%(w/w)混匀,备用。
[0086] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0087] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列3:1:1:2进行混合7
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0088] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度25℃下保温发酵20d。
[0089] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌30min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0090] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌15min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0091] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0092] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到1.124g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
110mg/100mL;组胺含量为21mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0093] 实施例6:
[0094] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0095] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐12%(w/w)混匀,备用。
[0096] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0097] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:1:2:1进行混合8
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0098] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度25℃下保温发酵25d。
[0099] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌30min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0100] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌15min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0101] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0102] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到1.009g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
112mg/100mL;组胺含量为20mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0103] 实施例7:
[0104] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0105] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐15%(w/w)混匀,备用。
[0106] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0107] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列1:1:3:1进行混合9
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0108] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度30℃下保温发酵5d。
[0109] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌20min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0110] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌25min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0111] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0112] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到0.873g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为97mg/
100mL;组胺含量为16mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。
[0113] 实施例8:
[0114] 一种利用动性球菌混合菌株发酵鱼露的方法,按照下述步骤进行:
[0115] (1)原料的处理:将碎鱼肉(鱼肉加工时所产生的废弃物)用碎肉机绞碎,加入腌制海盐15%(w/w)混匀,备用。
[0116] (2)混合发酵剂的制备:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)分别活化培养三次。将活化好的菌液于4℃、10000r/min离心10min,然后用无菌生理盐水洗涤两次,再悬浮于少量无菌生5 7
理盐水中,最后将菌液浓度调整到10~10CFU/mL,备用。
[0117] (3)混合发酵剂的添加:将海洋动性球菌(Planococcus maritimus XJ2)、普拉扣动球菌(Planococcus plakortidis XJ10)、德昌动性球菌(Planococcus dechangensis XJ11)和莱比托游动球菌(Planococcus rifietoensis XJ12)按菌数比列3:3:3:3进行混合9
并制备成混合发酵剂,按最终添加量10 CFU/g混入到预处理过的原料碎鱼肉中,使最终菌数达到添加要求即可。
[0118] (4)鱼露的发酵:把步骤(3)得到的混合物料在温度30℃下保温发酵30d。
[0119] (5)鱼露的过滤:将步骤(4)得到的鱼露样品于120℃灭菌20min,冷却至室温后于10000r/min离心20min,取上清液用多层纱布过滤以除去固形物和杂质。
[0120] (6)鱼露的灭菌:将步骤(5)得到的鱼露在100℃下进行二次灭菌25min,在无菌条件下灌装密封,即得鱼露成品。
[0121] (7)产品理化指标的评价:氨基酸态氮含量评价,方法参照GB5009.235‑2016比色法;挥发性盐基氮含量评价,方法参照GB5009.228‑2016微量扩散法;组胺含量的测定,方法参照GB5009.208‑2016分光光度法。
[0122] (8)鱼露理化指标结果:利用该株海洋动性球菌发酵鱼露的氨基酸态含量可达到0.981g/100mL,根据中国鱼露行业标准该鱼露划分为一级鱼露;挥发性盐基氮含量为
104mg/100mL;组胺含量为18mg/100mL,低于欧盟标准40mg/100mL。本鱼露中原料中固有的土腥味大大减少,鲜味明显,与未添加菌株发酵的鱼露相比,风味有显著提升。