[0057] 图1为Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318PCR扩增结果图;
[0058] 图中M为DNA Marker,1为Sao28‐318基因目的片段,2为Omp1626‐168/Sao28‐318PCR基因目的片段;
[0059] 图2为Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318重组质粒酶切鉴定结果图;
[0060] 图中M:DNA Marker,1:pET‐28a(+)‐Sao28‐318双酶切鉴定,2、pET‐28a(+)‐Omp1626‐168/Sao28‐318双酶切鉴定;
[0061] 图3为Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318纯化蛋白检测图
[0062] 图中M:蛋白分子量标准,1:Sao28‐318蛋白,2:Omp1626‐168/Sao28‐318蛋白具体实施方式
[0063] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法,通常按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编,科学出版社,1992,分子克隆实验指南(第三版);D.L.斯佩克特等,科学出版社,2001,细胞实验指南等书中所述的条件,或遵照制造厂商所建议的条件。
[0064] 【实施例1】Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318重组蛋白的构建
[0065] 1.引物的设计合成
[0066] 根据GenBank上已公布的Sao28‐318(GenBank Gene ID:61969363)、Omp1626‐168(GenBank Gene ID:333601408)基因序列,经过拼接,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成获得如下序列Omp1626‐168/Sao28‐318,设计合成两对引物,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,引物的序列如下:
[0067] 1)Sao28‐318基因PCR扩增引物
[0068] 上游引物P1
[0069] 5’-CGCCCATGGCGTCGGCACAAGAAGTAA-3’
[0070] 下游引物P2
[0071] 5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’
[0072] 2)Omp1626‐168/Sao28‐318基因PCR扩增引物
[0073] 上游引物P1
[0074] 5’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’
[0075] 下游引物P2
[0076] 5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’
[0077] 2.PCR(聚合酶链反应)扩增目的片段、纯化
[0078] 1)建立PCR反应体系:
[0079]
[0080] 用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃预变性5min;94℃30Sec,55℃30s,72℃1min进行35个循环;72℃7min。
[0081] 2)PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,电泳结果与预期扩增产物目的片段大小一致,如图1所示。在凝胶成像系统下,用灭菌的手术刀切下目的片段琼脂块。
[0082] 3)PCR产物回收纯化
[0083] 将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳后,于紫外灯下切取含有目的片段的凝胶,用DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)回收和纯化DNA,具体过程按照说明书进行。
[0084] 3.PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切及连接转化
[0085] 1)PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切
[0086] 将上述回收好的片段及原核表达载体pET‐28a(+)用NcoI和XhoI双酶切,37℃酶切2h,用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的片段。
[0087] 酶切体系如下:
[0088]
[0089] 2)目的片段与表达载体的连接
[0090] 酶切后根据回收的产物量,计算出应加入的相应体积,于4℃连接过夜。具体的连接体系如下:
[0091]
[0092] 3)化学转化
[0093] 将连接产物(10μL)加入到E.coli DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司),轻轻混匀,冰浴30min,42℃水浴锅中90s,再次冰浴3min,加入800μL预热的LB液体培养基,温和震荡复苏1h,5000rpm离心3min,弃去900μL上清,余液重悬菌体后,取200μL涂布于含0.1%硫酸卡那霉素的LB固体培养基上,37℃恒温培养12‐16h。
[0094] 4)鉴定阳性克隆
[0095] 挑取单克隆,37℃卡那霉素阳性LB液体培养基(100μg/mL)摇菌培养增殖12h,集菌。使用OMEGA试剂盒提取质粒,提取好的重组质粒用NcoI和XhoI双酶切,37℃酶切2h,双酶切后用0.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)
[0096] 酶切鉴定体系如下:
[0097]
[0098] 4.目的蛋白诱导表达
[0099] 1)诱导表达
[0100] 将酶切鉴定好的重组质粒以热激法方式转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,接种于5mLLB液体培养基中(卡那霉素100μg/mL),37℃过夜震荡培养,取200μL菌液接种至10mL新鲜配制的卡那霉素阳性(卡那霉素100μg/mL)LB培养基中,于37℃200rpm恒温培养3‐4h OD600≈0.6后,加入IPTG溶液,使其终浓度为1mmol/L,继续37℃培养,诱导表达6h,收集菌体,超声裂解,过Ni柱纯化,将纯化好的蛋白进行SDS‐PAGE电泳,结果得到符合目的蛋白大小的纯化蛋白,详见图3;
[0101] 2)上样和纯化
[0102] 将诱导表达好的菌液用50mL的离心管,12000rpm离心2min收集菌体,加入30mL Binding buffer重悬菌体,于超声破碎仪破碎细胞(400W,工作8s,间隔10s,50次)至菌液变清亮。12000rpm离心10min后,上清用0.45μm微孔滤膜过滤至干净的50mL离心管中,进行镍柱亲和层析,最终用5mL washing buffer洗脱,蛋白分装冻存于‐80℃备用。
[0103] 【实施例2】融合蛋白的抗原性鉴定
[0104] 将上述制备所得的融合蛋白进行SDS‐PAGE后的凝胶用半干法转印至PVDF膜上,37℃封闭1.5h,加入一抗(二免后采集的小鼠血清稀释一定倍数)于4℃封闭过夜。将膜用TBST洗涤后加入按1:2000稀释的二抗羊抗小鼠(IgG‐HRP),放置于摇床上室温2h,洗去二抗后用化学发光底物检测两种一抗与融合蛋白的反应情况。结果显示,在目的蛋白大小的位置出现了相应的条带,表明融合蛋白能与小鼠血清发生特异反应,有良好的免疫原性。
[0105] 【实施例3】融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318可以诱导较强的体液免疫应答[0106] 融合蛋白诱导的抗体水平检测
[0107] 采用常规ELISA检测免疫小鼠血清中抗Omp1626‐168/Sao28‐318特异性抗体水平。具体地,以人工合成并鉴定正确的Omp1626‐168/Sao28‐318包被96孔酶标板,4℃过夜;用PBST洗板3次,加入封闭液于37℃孵育2h;PBST用洗涤3次,以PBST缓冲液1∶100稀释被检血清,37℃孵育1.5h。3次洗板后,加入HPR标记的羊抗鼠IgG-HRP于37℃孵育1h;PBST洗板5次,TMB避光显色,2mol/L H2SO4终止反应,用酶标仪读取450nm的OD值,以确定血清抗体水平。结果显示融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318免疫组与Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏佐剂组一样,可以诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答反应,随着免疫次数的增加血清中特异性抗体的水平随之上升,相比较,Sao28‐318免疫组产生的体液免疫应答显著低于本发明所公布的融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318。
[0108] 【实施例4】Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318融合蛋白腹腔免疫小鼠的蛋白疫苗效能的检测
[0109] 研究2种亚单位疫苗腹腔接种小鼠所产生的免疫效果,验证对比Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318两种蛋白免疫效能。
[0110] 本发明采用BALB/c小鼠为动物模型。
[0111] 将纯化蛋白Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318进行乳化,并将二者分别与等体积的弗氏佐剂进行乳化,制备免疫原。
[0112] 取100只健康雌性BALB/c小白鼠、6周龄、体重16‐18g的SPF级BALB/c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)随机分成5组(对照组,Sao28‐318组,Sao28‐318+弗氏完全佐剂组,Omp1626‐168/Sao28‐318组,Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐剂组),腹腔注射,蛋白免疫剂量为50μg/只(100μL),对照组每只注射100μL PBS。一免后14天进行二免,二免的剂量与一免相同。二免后9天用猪链球2型以绝对致死量进行攻毒,攻毒后观察小鼠死亡情况并记录数据,记录时间为10d。结果显示,Sao28‐318组、Sao+弗氏完全佐剂组、Omp1626‐168/Sao28‐318组、Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐剂组对攻毒菌株的免疫保护率分别为30%、40%、70%、
80%。
[0113] 以上说明,Omp1626‐168/Sao28‐318具有对链球菌的免疫保护作用,并具有一定的自身佐剂作用。