[0028] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0029] 本发明的实施例所用的蓝藻Lyngbya majuscula于2016年11月采自海南三亚陵水港附近海域，由浙江理工大学韩兵男教授团队鉴定，样本保存在浙江理工大学。
[0030] HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
[0031] glucose为葡萄糖；
[0032] DMSO为二甲基亚砜；
[0033] hERG为人类ether-a-go-go相关基因；
[0034] HEK293细胞为人胚肾细胞；
[0035] EGTA为乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸；
[0036] 4-AP为4-氨基吡啶；
[0037] KAspartate为天冬氨酸钾盐；
[0038] Tris-ATP为腺苷三磷酸-三羟甲基氨基甲烷；
[0039] Cs-Aspartic acid为天冬氨酸铯盐。
[0040] 实施例1本发明提取物的提取方法，包括以下步骤：
[0041] ⑴粗提物制备：将干燥的蓝藻Lyngbya majuscula粉碎后，用2:1-1:1，V/V的采用渗漉法进行提取，得提取液，将提取液浓缩后得浸膏，将所得浸膏采用体积浓度为60％-70％，V/V的甲醇溶解后，再用二氯甲烷B进行萃取，萃取液浓缩后得粗提物；
[0042] 1、制备二氯甲烷粗提物
[0043] 将150g(干重)经过冷冻干燥的蓝藻Lyngbya majuscula剪碎，用1L体积比为2:1，V/V的二氯甲烷和甲醇的混合溶液渗漉提取5次，合并提取液，提取液经减压浓缩得浸膏，将浸膏用60％，V/V的甲醇水混悬，用二氯甲烷萃取3次，浓缩萃取液得到二氯甲烷粗提物20g；
[0044] 2、分离：将二氯甲烷粗提物经正向减压硅胶(200-300目)柱色谱VLC，先采用石油醚:乙酸乙酯系统＝5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1，V/V洗脱，最后用纯甲醇为溶剂进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析用硫酸香草醛显色分析，展开剂选用二氯甲烷:甲醇＝10:1，根据化合物极性不一样，层析板上显现出的点及颜色分布不同，合并相似流分，得到7个组分Fr.A–G；其中Fr.D组分是上述VLC中石油醚:乙酸乙酯＝1:2中的洗脱液，极性中等，通过做细胞毒实验，筛选出Fr.D有细胞毒活性。
[0045] 3、纯化：对组分Fr.D进行反相ODS柱色谱，反相柱层析所采用的反相层析柱为Interchim Ruriflash 450系统，条件为乙腈与水的体积比为10:90-100:0，流速25mL/min，根据TLC薄层层析用硫酸香草醛显色分析，展开剂选用二氯甲烷:甲醇＝20:1，根据化合物极性不一样，层析板上显现出的点及颜色分布不同，合并相似流分，得到21个组分Fr.D1–D21。
[0046] 对组分Fr.D9、Fr.D11、Fr.D17经半制备型HPLC[ Prep C18(10mm x 250mm，5μm)](流速3mL/min，检测波长为190nm，70％、65％、96.5％乙腈/水，保留时间为
40.0、20.0、28.5分钟)分别得到具有式(I)、式(II)、式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物。
[0047] 式(I)
[0048]
[0049] 式(II)
[0050]
[0051] 式(III)
[0052]
[0053] 4、结构鉴定
[0054] 本发明式(I)化合物：白色固体；HRESIMS m/z 495.2732[M+Na]+(calcd for C28H40O6Na,495.2723)。1H and 13C NMR核磁共振谱数据见表1；式(II)化合物：白色固体；HRESIMS m/z 613.2984[M+Na]+(calcd for C32H46O10Na,613.2989)。1H and 13C NMR核磁共+
振谱数据见表2；式(III)化合物：白色固体；HRESIMS m/z 595.2887[M+Na] (calcd for C32H44O9Na,595.2883)。1H and 13C NMR核磁共振谱数据见表3。
[0055] 表1化合物I的1H和13C NMR数据(600MHz和150MHz，in CDCl3)
[0056]
[0057] 表2化合物II的1H和13C NMR数据(600MHz和150MHz，in CDCl3)
[0058]
[0059] 表3化合物III的1H和13C NMR数据(600MHz和150MHz，in CDCl3)
[0060]
[0061] 实施例2本发明提取物的体外离子通道影响实验：
[0062] 对本发明具有式(I)-式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物以及对照化合物金合欢素进行体外离子通道影响的实验，所用材料为：hERG离子通道稳态表达的HEK293细胞，Kir2.1离子通道稳态表达的HEK293细胞,Nav1.5离子通道稳态表达的HEK293细胞,Nav1.8离子通道稳态表达的HEK293细胞，KV1.5离子通道稳定地表达在CHO细胞，Nav1.7离子通道稳定地表达在CHO细胞。这些材料均购自Sigma(St.Louis,MO)公司。
[0063] 1、实验原理
[0064] hERG,Kir2.1,Nav1.5,Nav1.8离子通道稳定地表达在HEK293细胞上。KV1.5，Nav1.7离子通道稳定地表达在CHO细胞上,电流稳定后，比较不同化合物浓度应用前后电流的大小，可以得到化合物对离子通道的影响。
[0065] 2、实验仪器
[0066] 膜片钳仪器：PC2C
[0067] 微操控仪器：MP-225
[0068] 拉制电极仪器：PC-10(Narishige，Japan)
[0069] 3、药物配制
[0070] 测试所需化合物除用于酸碱滴定的NaOH和KOH外，均从Sigma(St.Louis,MO)公司购买。式(I)-式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物以及对照化合物金合欢素的最终浓度均在当天配制，再溶于细胞外液。细胞外液(mM)为:NaCl,137；KCl,4；CaCl2,1.8；MgCl2,1；HEPES,10；glucose 10；pH 7.4(NaOH滴定)。所有测试化合物和对照化合物溶液均含0.3％DMSO。
[0071] 4、实验方法
[0072] ①细胞：所有实验都在室温下进行，每个细胞都以自身为对照。
[0073] ②式(I)-式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物及金合欢素的测试：待测化合物均采用利用自身重力的灌流系统进行灌流。在电流稳定(或5分钟)后，再比较式(I)-式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物及金合欢素使用前后的电流大小变化来计算阻断作用。
[0074] ③阳性对照：阳性对照浓度选择是根据它对细胞敏感性测试，阻断率90％左右的浓度为阳性对照最佳浓度。经测试4-AP(购自Sigma(St.Louis,MO)公司)为1000μM时，阻断率为90％左右，故阳性对照4-AP定为1000μM。方法和测试化合物一样。
[0075] ④电生理：将细胞转移到灌流槽中，用细胞外液进行灌流。KASP细胞内液(mM)为：KAspartate,130；MgCl2,5；EGTA,5；HEPES,10；Tris-ATP 4；pH 7.2(KOH滴定)。CsASP细胞内液(mM)为：Cs-Aspartic acid,130；MgCl2,5；EGTA 5；HEPES,10；Tris-ATP 4；pH 7.2(CsOH滴定)。细胞内液分批少量储存于-80度冰箱，实验当天融化。电极用PC-10(Narishige，Japan)拉制。全细胞膜片钳记录，噪音用采样频率的五分之一进行过滤。
[0076] ⑤IC50值采用origin8软件通过阻断率拟合得到的。
[0077] 5、实验结果
[0078] 相关实验数据见表4-表7，图1-图3。
[0079] 表4：式(I)化学结构的Aplysiatoxin衍生物对Kv1.5电流的阻断效应[0080]
[0081] N/A表示：没有测定。
[0082] 表5：式(II)化学结构的Aplysiatoxin衍生物对Kv1.5电流的阻断效应[0083]
[0084] N/A表示：没有测定。
[0085] 表6：式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物对Kv1.5电流的阻断效应[0086]
[0087]
[0088] N/A表示：没有测定。
[0089] 表7：阳性对照(4-AP)对Kv1.5电流的阻断效应
[0090]
[0091] 从实验数据可以看出，式(I)-式(III)化学结构的Aplysiatoxin衍生物对Kv1.5离子通道的阻断作用IC50分别为0.91μM、1.79μM、1.46μM，远远小于对照化合物金合欢素的IC50＝5.96±0.564μM。IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，IC50的数值越低，说明药物诱导能力越强。因此，与金合欢素相比，本发明中的三个新型Aplysiatoxin衍生物具有更强的抑制Kv1.5通道电流的作用。Kv1.5通道是IKur电流的分子基础，此电流参与心房肌动作电位复极化(APD)过程，而未发现在心室肌中发挥作用。Kv1.5通道阻滞剂能有效终止心房颤动并维持窦性心律，不具有室性心律失常的风险。因此，本发明中的三个新型Aplysiatoxin作为Kv1.5通道的特异性阻滞剂，极有可能成为未来心房颤动治疗的新型主导药物。
