[0019] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0020] 实施例1、左旋卡尼汀联合曲妥珠单抗对乳腺癌细胞的增殖抑制作用研究[0021] 1.试验材料
[0022] 左旋卡尼汀购自珠海亿邦制药有限公司，曲妥珠单抗购自罗氏公司，HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3购自上海中科院细胞库。
[0023] 2.试验方法
[0024] HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3用含10％胎牛血清的RPMI‑1640培养基(含100U·‑1 ‑1mL 青霉素和0.1mg·mL 链霉素)，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，细胞呈单层生长，达
80％左右融合时传代。将对数生长期的乳腺癌细胞SKBR3，用0.25％的胰酶和0.02％EDTA
4
混合消化液消化收集后，进行细胞计数，用新鲜的RPMI‑1640培养基稀释SKBR3至2×10 个/mL，100μL/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，培养24h 后，更换培养液，进行给药，给药组分为左旋卡尼汀组、曲妥珠单抗组、试验A组、试验 B组、试验C组、试验D组和试验E组，每组3复孔，并重复3次。各给药组中药物在培养液的终浓度分别为：
[0025] 左旋卡尼汀组：24μg/mL；
[0026] 曲妥珠单抗组：40μg/mL；
[0027] 试验A组：4μg/mL的左旋卡尼汀+40μg/mL的曲妥珠单抗；
[0028] 试验B组：16μg/mL的左旋卡尼汀+40μg/mL的曲妥珠单抗；
[0029] 试验C组：24μg/mL的左旋卡尼汀+40μg/mL的曲妥珠单抗；
[0030] 试验D组：32μg/mL的左旋卡尼汀+40μg/mL的曲妥珠单抗；
[0031] 试验E组：40μg/mL的左旋卡尼汀+40μg/mL的曲妥珠单抗；
[0032] 阴性对照组加入等体积的细胞培养液，空白对照组(无细胞)加入等体积PBS，用于调零，培养24h后，弃去各孔培养液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液和80μL培养基，继续培养4h。弃去各孔残液，每孔加入二甲基亚砜100μL，置摇床上低速振荡30min，使结晶物充分溶解。用酶标仪检测490nm波长处测量各孔的吸光值(A490)。
[0033] 细胞生长抑制率(％)＝[(阴性对照组A490‑空白组A490)‑(给药组A490‑空白组 A490)]/(阴性对照组A490‑空白组A490)×100％。
[0034] 3.试验结果
[0035] 表1.各给药组对HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3细胞增长抑制率
[0036] 组别 细胞增长抑制率(％)左旋卡尼汀组 8.12±1.04
***
曲妥珠单抗组 59.45±5.38
***
试验A组 60.93±6.87
***##
试验B组 81.30±6.12
***##
试验C组 90.04±5.96
***##
试验D组 85.42±5.34
***
试验E组 66.28±6.87
[0037] 注：与左旋卡尼汀组比较，***P＜0.001，与曲妥珠单抗组比较，##P＜0.01。
[0038] 结果显示，曲妥珠单抗单独给药对HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3增长具有较好的抑制效果，而左旋卡尼汀单独给药的抑癌效果较差，但是两者联合给药的抑癌效果显著增加，明显优于单独给予曲妥珠单抗和左旋卡尼汀的抑癌效果。由此说明，曲妥珠单抗和左旋卡尼汀组合用药产生协同的抑癌效果，左旋卡尼汀可显著增强曲妥珠单抗对乳腺癌细胞增长的抑制作用。曲妥珠单抗和左旋卡尼汀以1:(0.4～0.8)的质量比组合给药，对癌细胞生长抑制率达80％以上，当曲妥珠单抗和左旋卡尼汀以1:0.6的质量比组合给药时对乳腺癌细胞的抑制作用最强。
[0039] 实施例2、左旋卡尼汀联合曲妥珠单抗对裸鼠移植乳腺癌治疗作用的研究[0040] 1.试验材料及动物
[0041] 材料：左旋卡尼汀购自珠海亿邦制药有限公司，曲妥珠单抗购自罗氏公司，乳腺癌细胞株BT474细胞购自上海中科院细胞库。
[0042] 动物：SPF级BALB/c雌性裸鼠60只，6～8周龄，体重20～24g；裸鼠自由摄取常规饲料和自来水，饲养室温为22～25℃。
[0043] 2.试验方法
[0044] 取50只雌性裸鼠麻醉后，于裸鼠左前肢腋窝皮下注射200μL乳腺癌细胞株BT474细7
胞，细胞数浓度为1×10/mL，接种后每两天观察裸鼠肿瘤生长情况及其全身状况，掌握肿瘤的形成时间及生长情况，观察小鼠一般活动及营养状态等。每两天用游标卡尺测量肿瘤长径，待肿瘤的直径长至5‑7mm，即表明造模成功。筛选造模成功的裸鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为模型组、曲妥珠单抗组、左旋卡尼汀组、曲妥珠单抗+左旋卡尼汀组。另取剩余10只正常裸鼠作为空白对照组，测定给药前各组裸鼠的体重。
[0045] 各组给药剂量如下：
[0046] 空白对照组：腹腔注射等体积的生理盐水；
[0047] 模型组：腹腔注射等体积的生理盐水；
[0048] 曲妥珠单抗组：腹腔注射50mg/kg的曲妥珠单抗；
[0049] 左旋卡尼汀组：腹腔注射30mg/kg的左旋卡尼汀；
[0050] 曲妥珠单抗+左旋卡尼汀组：腹腔注射30mg/kg的左旋卡尼汀+50mg/kg的曲妥珠单抗；
[0051] 各组每周给药3次，连续给药4周。每天观察裸鼠的状态、如体重、食欲和精神等，4 周后称重，处死裸鼠，取出肿瘤并称重，计算抑瘤率＝(模型组瘤重‑用药组瘤重)/模型组瘤重×100％，采用免疫组化方法检测肿瘤组织中Bax、Bcl‑2和caspase‑3的表达，并对裸鼠尸体进行全面尸检，肉眼观察裸鼠心、肝、肾、肺、脾、胸腺、肠道等主要器官的变化。
[0052] 3.试验结果
[0053] 表2.各给药组裸鼠的瘤重(g)和抑瘤率(％)
[0054]组别 瘤重(g) 抑瘤率(％)
模型组 0.476±0.072 ‑
*
曲妥珠单抗组 0.341±0.054 28.36
左旋卡尼汀组 0.452±0.037 5.04
**
曲妥珠单抗+左旋卡尼汀组 0.215±0.069 54.83
[0055] 注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0056] 由表2可知，曲妥珠单抗和左旋卡尼汀以1:0.6质量比组合给药可显著减轻肿瘤的重量，其抑瘤率达54.83％，减轻肿瘤的效果与模型组比较具有极显著性差异，其效果优于单独给予曲妥珠单抗和左旋卡尼汀的治疗效果。
[0057] 表3.各给药组裸鼠肿瘤组织中的Bax、Bcl‑2和caspase‑3的表达比较(OD值)[0058]
[0059] 注：与空白对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
[0060] 由表3可知，与空白对照组比较，乳腺癌模型组裸鼠肿瘤组织中的抑凋亡蛋白Bcl‑2表达增加，促凋亡蛋白Bax和细胞凋亡终末剪切酶caspase‑3表达减少，给予曲妥珠单抗治疗可显著增加促凋亡蛋白Bax和细胞凋亡终末剪切酶caspase‑3表达，减少抑凋亡蛋白Bcl‑
2 表达，促进乳腺癌肿瘤组织凋亡，发挥抗肿瘤的作用。此外，当曲妥珠单抗和左旋卡尼汀以1:0.6质量比组合给药时的效果最佳，优于单独给予曲妥珠单抗和左旋卡尼汀的效果。
[0061] 此外，对各试验组裸鼠进行全面尸检，结果发现，曲妥珠单抗和左旋卡尼汀组合治疗组的裸鼠的心、肝、肾、肺、脾、胸腺、肠道、胃部均没有出现异常，表明曲妥珠单抗和左旋卡尼汀组合给药的安全性较高。
[0062] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
