[0017] 实施例1、结构式为I-XII的化合物的制备
[0018] 本发明采用微生物转化方法，以20(R)-人参三醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括：犁头霉(Absidia)，小克银汉霉(Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，链格孢(Alternaria)，红酵母(Rhodotorula)，共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属的微生物；其中转化能力较强的是犁头霉(Absidia)和毛霉(Mucor)属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心(CICC)，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。真菌培养基选用马铃薯培养基，细菌培养基选用LB培养基。
[0019] 马铃薯培养基的配制(PDA培养基)：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80℃保温1h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3％琼脂。
[0020] 细菌培养基的制备(LB培养基)：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5％琼脂。
[0021] 以总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205为例，制备结构式为I-XII的化合物的过程如下：
[0022] 1)发酵、转化以及萃取
[0023] 将总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg 20(R)-人参三醇(0.2mL，125mg/mL无水乙醇溶液)，共用500mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约1.6g。
[0024] 2)硅胶柱纯化
[0025] 将所得粗提物溶于少量甲醇，与1.6g柱色谱硅胶(200–300目)混合拌样，自然干燥，加至装有50g硅胶(200–300目)的色谱柱顶，用二氯甲烷–无水乙醇系统梯度洗脱(50:1-1:8)，收集洗脱组分，采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，二氯甲烷–无水乙醇(15:1)展开，
10％硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色)将所得到的相似洗脱组分合并。
[0026] 3)反相高效液相色谱纯化
[0027] 合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC-Pack OSD-A，5μm，12.0×250mm(日本YMC)，乙腈-水(60:40，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长203nm。得到结构式为I-XII的12个转化产物，如图1所示。其13C-NMR数据如表1所示。
[0028] 表1.式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的碳谱数据(CDCl3)
[0029]
[0030]
[0031] 以上结果表明，所得化合物结构正确。
[0032] 利用其他属的微生物，具体如刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450、少根根霉Rhzopus arrhizus AS 3.3457、顶头孢Acremonium strictum AS 3.2059，均可以采用以上相同的过程来制备得到结构式为式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物。
[0033] 实施例2本发明化合物I-XII的抗肝纤维化活性
[0034] 1)实验材料
[0035] 仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPM I 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
[0036] 测试用细胞株：HSC-T6细胞株，为SV40转染的SD大鼠肝星状细胞，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
[0037] 测试样品：化合物I-XII，纯度在90％以上，阳性对照品秋水仙碱，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
[0038] 2)实验方法
[0039] 采用MTT法测定各受试化合物对HSC-T6细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的HSC-T6细胞，用含1％DMEM培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0..1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定450nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS 11.5软件作回归方程，计算各受试样品对HSC-T6细胞作用72h的半数抑制浓度(IC50)。
[0040] 3)实验结果
[0041] 根据MTT法测试结果，计算本发明化合物I-XII对上述细胞的IC50值，结果如表2所示。
[0042] 表2.测试样品对HSC细胞增殖的抑制作用
[0043]Compound HSC-T6 IC50 value(μM)
秋水仙碱 0.18
化合物I 9.4
化合物II 10.3
化合物III 7.2
化合物IV 4.8
化合物V 3.1
化合物VI 12.4
化合物VII 14.8
化合物VIII 20.6
化合物IX 15.3
化合物X 11.4
化合物XI 17.8
化合物XII 21.5
[0044] 结果表明，本发明的20(R)-人参三醇(PT)衍生物I-XII具有良好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝纤维化药物的活性成分。
