盲专网 - 抑制lncRNA表达在胃癌治疗中的应用

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2019-07-31

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2019-11-22

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2039-07-31

基本信息

有效性	实质审查	专利类型	发明专利
申请号	CN201910704734.0	申请日	2019-07-31
公开/公告号	CN110387372A	公开/公告日	2019-10-29
授权日		预估到期日	2039-07-31
申请年	2019年	公开/公告年	2019年
缴费截止日
分类号	C12N15/113 、C12N15/85 、A61K31/7105 、A61K48/00 、A61K33/24 、A61P35/00	主分类号	C12N15/113
是否联合申请	独立申请	文献类型号	A
独权数量	1	从权数量	9
权利要求数量	10	非专利引证数量	0
引用专利数量	0	被引证专利数量	0
非专利引证
引用专利		被引证专利
专利权维持	99	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查

申请人信息

申请人	宜春莲泽生物科技发展有限公司	第一申请人	宜春莲泽生物科技发展有限公司
专利权人	宜春莲泽生物科技发展有限公司	当前专利权人	宜春莲泽生物科技发展有限公司
发明人	巫满香、陈印平	第一发明人	巫满香
地址	江西省宜春市袁州区银泰广场8栋501	邮编	336000
申请人数量	1	发明人数量	2
申请人所在省	江西省	申请人所在市	江西省宜春市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

摘要

本发明分析发现了胃癌细胞与正常细胞相比00211901lncRNA表达存在差异，通过构建siRNA敲除细胞系发现该转染的胃癌细胞能够得到抑制，同时联合顺铂治疗时转染了siRNA的胃癌细胞的抑制率也得到了显著的提高，具有较好的应用价值。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2019-11-22	实质审查的生效	IPC(主分类): C12N 15/113 专利申请号: 201910704734.0 申请日: 2019.07.31
2	2019-10-29	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种00211901 lncRNA，其序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种siRNA，其序列为ggatggatctctctgagtga。

3.一种过表达载体，其为真核表达载体pcDNA3.0-00211901，其特征在于:在真核表达载体pcDNA3.0中连接SEQ ID No：1所示的00211901 lncRNA。

4.一种抑制胃癌细胞增殖的药物组合物，其特征在于：含有SEQ ID NO：2所示的siRNA以及药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。

6.抑制如SEQ ID No：1所示的00211901 lncRNA表达的抑制剂在用于制备治疗胃癌的药物中的用途。

7.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于含有SEQ ID NO：2所示的siRNA以及化疗药物和药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于所述的化疗药物是顺铂。

9.SEQ ID NO：2所示的siRNA在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

10.SEQ ID NO：2所示的siRNA以及化疗药物和药学上可接受的载体在制备用于治疗胃癌的药物中的用途；所述的化疗药物是顺铂。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体的涉及通过抑制lncRNA表达在胃癌治疗中的应用。

背景技术

[0002] 胃癌(gastriccancerGC)是消化系统最常见的恶性肿瘤，其致死率在世界范围内居恶性肿瘤第3位。全球大约50％的胃癌患者分布在东亚，中国的胃癌发病率大约为美国的6倍，造成了巨大的经济以及公共卫生负担。吸烟，饮酒，饮食习惯及幽门螺杆菌感染与胃癌发病风险显著相关。环境因素和宿主相关因素的相互作用是胃癌高死亡率的关键因素，对与胃癌相关异常基因进行深入的分子生物学探究对改善患者结局至关重要。随着肿瘤生物学的深入研究及分子技术水平的提高，胃癌的分子机制研究也不断取得进步。非编码RNA(ncRNA)近来已成为了新的疾病分子机制的研究热点。ncRNA影响致癌基因和抑癌基因等相关基因的正常表达，使其成为胃癌药物开发的潜在新靶标或者早期诊断的分子标志物。目前ncRNA中，微小RNA(microRNA)和长链非编码RNA(ln-cRNA)在胃癌中的研究较为广泛和深入。

[0003] lncRNA是长度超过200个碱基的RNA分子，不具有蛋白编码能力。lncRNA虽不参与蛋白质的表达，但能以RNA形式在表观遗传学，转录及转录后等多种层面调控基因的表达。随着研究的不断深入，lncRNA被发现参与调节多种重要的细胞活动，如调控基因表达、转录干扰与激活、蛋白质活化等多种重要的生物学过程。lncRNA可以作为致癌或抑癌基因参与肿瘤的发生发展。通过对比肿瘤细胞和正常细胞的表达谱，发现多种lncRNA在不同类型肿瘤中异常表达。lncRNA有望成为新型肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点，用于肿瘤的诊断、治疗和预后监测。

[0004] 有研究表明lncRNA在胃癌组织和正常组织中表达有显著差异，lncRNA可能成为胃癌潜在的早期诊断标志物。Zhang等对胃癌患者的组织样品和相邻的正常组织进行lncRNA筛选分析，然后对胃癌相关lncRNA进行定量分析，研究发现血浆lncRNA(TINCR，CCAT2，AOC4P，BANCR和LINC00857在胃癌细胞株中表达均显著上调。此外，另有研究报道:lncRNA(H19，LINC00152，uc0011sz)及lncRNA MALATl的高表达与胃癌的发病风险增加有关。新近研究发现lncRNAs AK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG和CEBPA-AS1在人胃癌组织中富集，并在胃癌患者的血浆中显著升高。上述lncRNA在胃癌组织及细胞中均作为致癌基因，促进胃癌的发生发展。不同种类的lncRNAs在胃癌中差异表达，利用他们表达的特性，可能被用作诊断胃癌发生的潜在分子标志物。

[0005] 新近研究发现，lncRNA的异常表达在肿瘤恶性发展过程中起重要作用，参与了血管生成、细胞增殖、迁移和凋亡。前期有研究报道，lncRNA SPRY4-ITl可通过促进EMT和抑制E钙粘蛋白的表达来促进肿瘤细胞的侵袭和转移。新近研究发现，lncRNA MALAT-1及lncRNA DANCR均通过促进EMT来促进胃癌细胞的迁移和侵袭。另有研究发现lncRNA 00152及lncRNA MALAT-1可通过与zeste同源物2(enhancer of zeste homolog 2EZH2)的增强子结合，从而促进胃癌细胞迁移和侵袭。泛素连接酶(caritas B-lineage lymphoma-C)是酪氨酸激酶信号传导的关键调节剂，Wang等研究发现lncRNA UCA1通过促进Cbl-c介导的G蛋白偶联受体激酶2(G protein}oupled receptor kinase 2)泛素化来调节GRK2蛋白的稳定性从而增加胃癌细胞的转移能力。目前对于lncRNA在胃癌侵袭转移中的作用研究相对较少，已发现部分1neRNAs通过靶向调节相关蛋白的表达来影响胃癌细胞的侵袭转移。

[0006] 在专利领域胃癌涉及lncRNA的研究也有一些。CN107488740A公开了检测胃癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒，利用荧光定量PCR或数字PCR技术鉴定胃癌病人样本(样本可以是组织、血浆、血清胃液等)及对应的癌旁样本或者正常样本中特定的一组LncRNA表达量的差异变化，及早准确评估胃癌复发或转移的风险。试剂盒提供了检测胃癌预后情况的生物标记物LncRNA组合及检测该组合中包含的LncRNA的引物和相关试剂，能有效提高胃癌预后复发或转移的检测效率及准确率。

[0007] CN103834738B公开了一种胃液中lncRNA的提取与检测方法，包括胃液抽取、胃液预处理、三氯甲烷提取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥RNA、RNA逆转录、PCR检测等步骤，与现有技术相比，优点在于：通过对胃液预处理、氯仿提取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤、RNA逆转录和PCR检测步骤，去除了胃液中多糖、粘蛋白等杂质，在简化实验操作步骤的基础上实现了对胃液中lncRNA高质量、高产率的提取，实现了对目标lncRNA荧光定量RT-PCR检测，通过对130例胃液样本GAPDH的Ct值分析，发现了GAPDH是胃液中一个良好的外参基因，在此基础上又提出了用于判断胃液总RNA质量的GAPDH参考Ct值范围，对进一步研究胃液中lncRNA的出现规律及其与生理状态和疾病发生的关系具有重要的意义。

[0008] 由于在现有技术中整体上lncRNA与胃癌的关系还很少，研究方向还有很大的进步空间，促使了发明人研究并发现了lncRNA与胃癌的关系。

发明内容

[0009] 本发明通过高通量测序比对发现了00211901 lncRNA在胃癌细胞与普通细胞之间差异表达，特别的是，在胃癌细胞中高表达。

[0010] 本发明提供一种00211901 lncRNA，其序列如SEQ ID No：1所示。

[0011] 一种siRNA，其序列为ggatggatctctctgagtga。

[0012] 一种过表达载体，其为真核表达载体pcDNA3.0-00211901，其为真核表达载体pcDNA3.0中连接SEQ ID No：1所示的00211901 lncRNA。

[0013] 一种抑制胃癌细胞增殖的药物组合物，其特征在于含有SEQ ID NO：2所示的siRNA以及药学上可接受的载体。

[0014] 进一步的，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

[0015] 进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。

[0016] 本发明另外共一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于含有SEQ ID NO：2所示的siRNA以及化疗药物和药学上可接受的载体。

[0017] 进一步的，所述的化疗药物是顺铂。

[0018] 进一步的，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

[0019] 进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。

[0020] 本发明还提供了SEQ ID NO：2所示的siRNA在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

[0021] 本发明还提供了SEQ ID NO：2所示的siRNA以及化疗药物和药学上可接受的载体在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

[0022] 进一步的，所述的化疗药物是顺铂。

[0023] 进一步的，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

[0024] 进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。

实施方案

[0030] 下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。

[0031] 实施例1 00211901 lncRNA过表达与抑制表达

[0032] 胃癌细胞MKN74细胞，货号为BS-C61866280，购买自上海宾穗生物科技有限公司，按照说明书进行培养传代制3代准备转染。

[0033] 采用脂质体2000试剂(美国Invitro}en公司)转染siRNA-00211901(5’-ggatggatctctctgagtga-3')和真核表达载体pcDNA3.0-00211901(采用本领域常规的构建方法进行构建；其中00211901的序列如SEQ ID NO：1所示)，具体的转染前将胰酶消化生长至对数期的MKN74细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，常规培养24h，将siRNA转染细胞，将转染后的胃癌细胞进行常规的培养，48h后统一检测00211901基因敲除与过表达。

[0034] 实施例2 RNA提取与实时荧光定量聚合酶链反应检测

[0035] 采用TRIzoI试剂提取转染前后胃癌细胞总RNA。根据制备工艺，采用Bestar逆转录系统荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒。采用7500型实时FQ-PCR系统(美国ABI公司)作实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测(双链DNA在90-95℃变性，再迅速冷却至40-60℃，引物退火并结合至靶序列上，然后快速升温至70-75℃，循环30-40次)。每种检测方法均为三联法，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内源性对照基因。所用引物序列:00211901 5'-agactggcttcctctctcct一3’(forward)，5’一atgggatccaaatatcttcc-3’(reverse)；GAPDH 5’一TGTTC-GTCATGGGTGTGAAC一3’(forward),5’-ATGGCATG-GACTGTGGTCAT-3'(reverse)。
方法计算00211901和GAPDH相对量，并以GAPDH cDNA作内对照。结果如图1所示，转染siRNA的胃癌细胞中00211901的量非常低，而导入了过表达载体的胃癌细胞中00211901的量得到了超表达。

[0036] 实施例3细胞细胞凋亡检测

[0037] 收集转染48h的细胞，取1ml细胞，预冷PBS洗涤及1×Bindingbuffer重悬后，分别加入AnnexinV-FITC和PI，各为5μl和10μl，室温避光15～20min，加1×Bindingbuffer300μl，1h内流式细胞仪检测。实验重复3次。统计学方法采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用x±s表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

[0038] siRNA转染诱导MKN74细胞凋亡各组细胞凋亡率检测结果如图2流式细胞术检测转染的胃癌细胞凋亡率所示，siRNA组细胞凋亡率显著高于空白组和过表达组(P<0.05)。具体的，siRNA组细胞凋亡率达到(35.23±1.01)％，而空白组和过表达组细胞凋亡率基本都是在5％左右，差异显著，这充分说明，抑制00211901的表达能够提高胃癌的细胞凋亡率。

[0039] 实施例4 siRNA联合顺铂对胃癌细胞的影响

[0040] 胃癌细胞转染siRNA 24h后，分别给予不同浓度顺铂作用48h后，细胞增殖被抑制，并且呈剂量依赖性。其中siRNA组在1.5、3、4.5μg/ml顺铂浓度作用下的细胞增殖率与NC空白组(也添加相同浓度的顺铂)相比明显被抑制(P＜0.05)，表明沉默00211901提高了胃癌细胞对顺铂的敏感性，增强了其抗肿瘤的效果。见图3。而且最终的抑制率上，导入了siRNA的胃癌细胞也是较高水平的被抑制，具有较好的应用价值和市场前景。

[0041] 上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

附图说明

[0025] 图1为胃癌细胞中00211901的表达量图。

[0026] 图2为流式细胞术检测转染的胃癌细胞凋亡率图。

[0027] 图3为胃癌细胞的抑制率图。

[0028] 有益效果

[0029] 本发明分析发现了胃癌细胞与正常细胞相比00211901 lncRNA差异表达，通过构建siRNA敲除细胞系发现该转染的胃癌细胞能够得到抑制，同时联合顺铂治疗时转染了siRNA的胃癌细胞的抑制率也得到了显著的提高，具有较好的应用价值。

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抑制lncRNA表达在胃癌治疗中的应用 0 0

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