[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0023] 实施例1、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)的分离培养方法,依次进行以下步骤:
[0024] 1、于四川中江采集野生丹参植株,根部洗净后25KHz超声波处理5分钟;
[0025] 2、在无菌条件下,对步骤1所得的供试材料用灭菌去离子水冲洗3次,并依次用75%(v/v)的酒精和3%(m/V)次氯酸钠溶液表面消毒;
[0026] 3、在无菌环境中,继续将步骤2所得供试材料用无菌水冲洗3次,取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于营养琼脂上,30℃培养24h后,进行无菌验证。
[0027] 如无菌落产生,则继续后续的步骤4;如有菌落产生,则返回步骤2继续表面消毒处理。
[0028] 4、在超净台中,取处理好的丹参根样品1~2g,在无菌研钵中充分研磨,并加入5mL无菌水,混匀,静置15min,取100μl上清稀释涂布于营养琼脂培养基中,置于28~32℃(较佳30℃)培养1~3天;
[0029] 5、挑取步骤4中所产的单菌种于相同培养基划线纯化分离,置于28~32℃(较佳30℃)培养1~3天,继续挑取单菌落;
[0030] 重复上述操作直至得到纯培养为止。
[0031] 6、将步骤5中所得到的单菌落进行16s rDNA序列测定,经序列比对,确定菌株,并保藏。得Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)。
[0032] 实施例2、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)菌体诱导子的制备方法,依次进行以下步骤:
[0033] 1、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)转接于营养琼脂斜面,28℃培养2天;
[0034] 营养琼脂斜面:蛋白胨10g,牛肉膏3g,NaCl 5g,琼脂18g和蒸馏水1000mL,pH=7.2~7.4。
[0035] 2、用接种环挑取1环步骤1所得的斜面菌种,接种于含50ml营养肉汤培养基的250ml三角瓶中,于28℃以220rpm培养72h,得Olivibacter soli LG3CCTCC M 2015084发酵原液;
[0036] 营养肉汤培养基配方为:蛋白胨10g,牛肉膏3g,NaCl 5g和蒸馏水1000mL,pH=7.2~7.4。
[0037] 上述步骤1和步骤2均在自然光条件下培养。
[0038] 3、取步骤2所得发酵原液,于4℃,12000rpm,离心2min,菌体沉淀用去离子水清洗3次,重悬于50mL去离子水,121℃,高压灭菌20min。灭菌后的菌体悬浮液用三层0.22μm滤膜进行真空抽滤,所得滤液为菌体诱导子。
[0039] 实施例3、Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)菌体诱导子对丹参毛状根水溶性成分促进实验:
[0040] 1、0.3g的丹参毛状根(母根)接种于含100ml的6,7-V培养基的250ml三角瓶中,在25℃,100rpm避光培养18天,作为基础物;
[0041] 实验组:在每个基础物中加入1.5ml的Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)菌体诱导子(实施例2所得),继续相同条件(25℃,100rpm,避光)培养6天;作为实验组;
[0042] 阴性对照:在每个基础物中加入1.5ml的无菌去离子水,继续相同条件(25℃,100rpm,避光)培养6天;作为空白对照组;
[0043] 上述实验组和阴性对照(空白对照组)分别设置5个重复。
[0044] 将实验组和阴性对照所得的丹参毛状根分别进行如下操作:
[0045] 2、培养结束后用蒸馏水将步骤1得到的毛状根清洗三遍,用吸水纸吸干水分中,称鲜重(fresh weight,FW);后将已称鲜重的毛状根放入烘箱,55℃干燥至恒重,测定干重(dry weight,DW)。
[0046] 3、取适量烘至恒重的丹参根,研磨成粉末。取0.5g干粉加入2.5mL的70%甲醇,120W超声波清洗机中超声萃取60min(超声过程中水温不可过高,可适当加入冰块,即,控制温度≤20℃),萃取液过0.45μm微孔滤膜,用高效液相色谱(HPLC)的方法方法进行迷迭香酸和丹酚酸B含量的测定。
[0047] 测定结果如下:
[0048] 实验组中加入Olivibacter soli LG3(CCTCC NO:M 2015084)诱导子的毛状根鲜重平均比空白对照组增加了23.9%,迷迭香酸含量比空白对照组高16%,丹酚酸B含量比空白对照组高44%。具体如表1所述。
[0049] 对比例:分别选用以下现有Olivibacter soli菌株及本属相近种的菌株作为对比例,具体菌株如下:
[0050] A、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23492的Olivibacter soli菌株;
[0051] B、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23491的Olivibacter ginsengisoli菌株;
[0052] C、比利时BCCM/LMG保藏机构保藏的代码编号为LMG 23494的Olivibacter terrae菌株;
[0053] D、德国微生物菌种保藏中心DSMZ保藏的代码编号为DSM 17696的Olivibacter sitiensis;
[0054] 将上述Olivibacter菌株按照上述实施例2所述的“菌体诱导子制备”和实施例3所述的“对丹参毛状根酚酸类物质积累的促进实验”进行,最终所得的结果如下表1所示。
[0055] 表1.Olivibacter soli LG3CCTCC M 2015084及对比例对丹参毛状根酚酸类物质积累的影响
[0056]
[0057] 表中为实验平均值±标准偏差
[0058] 最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。