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能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法   0    0

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专利申请流程有哪些步骤?
专利申请流程图
申请
申请号:指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。
申请日:提出专利申请之日。
2014-11-26
申请公布
申请公布指发明专利申请经初步审查合格后,自申请日(或优先权日)起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。
申请公布号:专利申请过程中,在尚未取得专利授权之前,国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。
申请公布日:申请公开的日期,即在专利公报上予以公开的日期。
2015-04-29
授权
授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由,授予发明专利权;或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由,授予实用新型专利权或外观设计专利权。
2016-08-24
预估到期
发明专利权的期限为二十年,实用新型专利权期限为十年,外观设计专利权期限为十五年,均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。
2034-11-26
基本信息
有效性 有效专利 专利类型 发明专利
申请号 CN201410689796.6 申请日 2014-11-26
公开/公告号 CN104472358B 公开/公告日 2016-08-24
授权日 2016-08-24 预估到期日 2034-11-26
申请年 2014年 公开/公告年 2016年
缴费截止日
分类号 A01H4/00 主分类号 A01H4/00
是否联合申请 独立申请 文献类型号 B
独权数量 1 从权数量 2
权利要求数量 3 非专利引证数量 4
引用专利数量 1 被引证专利数量 0
非专利引证 1、李文渊等.“诱导子对丹参有效成分次生代谢的诱导与调控”.《中国中药杂志》.2011,第36卷(第3期),第258-262页.; 2、王学勇等.“诱导子对丹参毛状根中丹参酮类成分积累影响”.《中国中药杂志》.2007,第32卷(第10期),第976-978页.; 3、袁晓凡等.“稀土元素在药用植物细胞和组织培养中的应用”.《植物学通报》.2005,第22卷(第1期),第115-120页.; 4、郭肖红.“丹参不定根组织培养的研究”.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 医药卫生科技辑》.2007,(第6期),第E057-1页.;
引用专利 CN1392252A 被引证专利
专利权维持 3 专利申请国编码 CN
专利事件 事务标签 公开、实质审查、授权
申请人信息
申请人 第一申请人
专利权人 浙江理工大学 当前专利权人 浙江理工大学
发明人 梁宗锁、杨东风、韩名宇、郭万里、杨宗岐、金伟波、刘岩 第一发明人 梁宗锁
地址 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街5号 邮编
申请人数量 1 发明人数量 7
申请人所在省 浙江省 申请人所在市 浙江省杭州市
代理人信息
代理机构
专利代理机构是经省专利管理局审核,国家知识产权局批准设立,可以接受委托人的委托,在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。
杭州中成专利事务所有限公司 代理人
专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务,取得一定资格的人。
金祺
摘要
本发明公开了一种能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法,包括以下步骤:1)丹参毛状根的初培养:在每50mL的6,7?V培养基接种0.15~0.2g丹参毛状根,于100~150rpm、24~26℃的培养条件下黑暗培养17~19天;2)丹参毛状根的继续培养:然后添加硝酸铈,使6,7?V培养基中硝酸铈的终浓度为45~55μM;于100~150rpm、24~26℃的培养条件下黑暗培养(诱导培养)5~7天。采用本发明的方法能够促进丹参毛状根中丹参酮(包括隐丹参酮和二氢丹参酮I)的积累。
  • 摘要附图
    能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法
  • 说明书附图:图1
    能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法
法律状态
序号 法律状态公告日 法律状态 法律状态信息
1 2016-08-24 授权
2 2015-04-29 实质审查的生效 IPC(主分类): A01H 4/00 专利申请号: 201410689796.6 申请日: 2014.11.26
3 2015-04-01 公开
权利要求
权利要求书是申请文件最核心的部分,是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。
1.能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法,其特征是包括以下步骤:
1)、丹参毛状根的初培养:
在每50mL的6,7-V培养基接种0.15~0.2g丹参毛状根,于100~150rpm、24~26℃的培养条件下黑暗培养17~19天;
2)、丹参毛状根的继续培养:
然后添加硝酸铈,使6,7-V培养基中硝酸铈的终浓度为45~55μM;于100~150rpm、24~
26℃的培养条件下黑暗培养5~7天;
所述丹参酮为隐丹参酮和二氢丹参酮I。

2.根据权利要求1所述的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法,其特征是:
步骤2)中硝酸铈的终浓度为50μM。

3.根据权利要求1或2所述的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法,其特征是:
所述步骤1)和步骤2)的培养条件均为:110rpm,25℃,
步骤1)的黑暗培养时间为18天,步骤2)的黑暗培养时间为6天。
说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及一种能够促进丹参毛状根中隐丹参酮和二氢丹参酮I积累的诱导方法。

背景技术

[0002] 丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科植物丹参的根及根茎,有活血祛瘀,清热安神、养血益气之功效。丹参酮是丹参的主要有效成分之一,主要包括隐丹参酮和二氢丹参酮I。由于在治疗心血管系统疾病中的突出表现和无毒负作用的特点,丹参的应用和研究也越来越广泛。
[0003] 目前现有的丹参毛状根可采用6,7-V培养基进行培养。一般称取新鲜毛状根0.15~0.2g接种于50mL的6,7-V培养基中进行黑暗培养。
[0004] 含30g/L蔗糖的6,7-V培养基的配方如表1所示,pH值为5.8,121℃灭菌20 min。
[0005] 表1、6,7-V培养基的配方
[0006]
[0007]
[0008] 硝酸铈的主要用途为:用于制造煤气灯网罩、药物、试剂,并用于原子能、电子管等工业。其对植物种子的发芽、生根和生长具有刺激促进作用,能提高农作物的质量和产量。有报道显示,1mM硝酸铈诱导处理可以提高红豆杉中紫杉醇的的产量。但是,目前没有关于硝酸铈能用于促进丹参毛状根中丹参酮积累的报道。

发明内容

[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种能够促进丹参毛状根中丹参酮(包括隐丹参酮和二氢丹参酮I)积累的诱导方法。
[0010] 为了解决上述技术问题,本发明提供一种能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法,包括以下步骤:
[0011] 1)、丹参毛状根的初培养:
[0012] 在每50mL的6,7-V培养基接种0.15~0.2g丹参毛状根,于100~150rpm、24~26℃的培养条件下黑暗培养17~19天;
[0013] 2)、丹参毛状根的继续培养:
[0014] 然后添加硝酸铈,使6,7-V培养基中硝酸铈的终浓度为45~55μM;于100~150rpm、24~26℃的培养条件下黑暗培养(诱导培养)5~7天;从而实现促进丹参毛状根中丹参酮(隐丹参酮和二氢丹参酮I)的积累。
[0015] 作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法的改进:
[0016] 步骤2)中硝酸铈的终浓度为50μM。
[0017] 作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹参酮积累的诱导方法的进一步改进:
[0018] 步骤1)和步骤2)的培养条件均为:110rpm,25℃,
[0019] 步骤1)的黑暗培养时间为18天,步骤2)的黑暗培养时间为6天。
[0020] 备注说明:
[0021] 1、所述步骤1)和2)均在超净台中进行,此属于常规技术。
[0022] 2、本发明所用的丹参毛状根为采用发根农杆菌(ATCC15834)侵染丹参试管无菌苗获得;从生长旺盛的毛状根中选取色泽新鲜的部分;此也属于常规技术。
[0023] 收集经本发明方法诱导处理后的丹参毛状根,用蒸馏水冲洗,再用干净的纸吸干水份,最后在50~60℃烘箱中干燥至恒重后进行隐丹参酮和二氢丹参酮I的含量检测(为常规技术)。例如可采用以下方法:
[0024] 干燥毛状根研钵中磨碎,过0.45mm筛,精密称取0.02g,放入5mL离心管中,加入2.5mL甲醇-水(7:3的体积比)提取液,于40K HZ下超声提取45min,提取液12000rpm离心
15min,取上清液过0.45μm滤膜,备用。
[0025] 色谱条件为:以A乙腈和B 0.01%磷酸水溶液为流动相,Waters 2996二极管阵列检测器检测,流速1.0mL/min,柱温30℃,测定隐丹参酮和二氢丹参酮I含量。
[0026] 以取消步骤2)中硝酸铈的使用为对照(CK),即,对照中硝酸铈的终浓度为0μM。
[0027] 结果表明(如图1所示):本发明的50μM硝酸铈处理时隐丹参酮和二氢丹参酮I含量分别达到0.27mg/g和0.87mg/g,与对照(不添加硝酸铈)相比均有了大大提高。因此,本发明能够显著促进隐丹参酮和二氢丹参酮I的积累。

实施方案

[0030] 实施例1、一种能够促进丹参毛状根中丹参酮(隐丹参酮和二氢丹参酮I)积累的诱导方法,依次进行以下步骤:
[0031] 1)、丹参毛状根的初培养:
[0032] 在超净台中,称取0.2g丹参毛状根放入装有50ml的6,7-V培养基中(100ml锥形瓶,pH:5.8),摇床转速110rpm,25℃下黑暗培养18天。
[0033] 2)、丹参毛状根的继续培养:
[0034] 丹参毛状根培养18天后,添加硝酸铈,使6,7-V培养基中硝酸铈的终浓度为50μM;于110rpm,25℃的黑暗条件下诱导培养6天。
[0035] 诱导6天后收集毛状根,用蒸馏水冲洗,再用干净的纸吸干水份,最后在50~60℃烘箱中干燥至恒重后进行隐丹参酮和二氢丹参酮I的含量检测。
[0036] 以取消步骤2)中硝酸铈的使用为对照(CK),即,对照中硝酸铈的终浓度为0μM。
[0037] 所得结果如图1所示:
[0038] 结果表明50μM硝酸铈处理隐丹参酮和二氢丹参酮I含量分别达到0.27mg/g和0.87mg/g,而CK中隐丹参酮和二氢丹参酮I含量分别为0.05mg/g和0.24mg/g。
[0039] 因此,本发明与对照相比分别提高了4.93倍和3.71倍。
[0040] 对比例1、将实施例1中硝酸铈的终浓度由50μM分别改成5、20、100、200μM,其余等同于实施例1。
[0041] 所得结果如图1所示。
[0042] 根据图1,我们得知:5、20、100和200μM浓度下的硝酸铈处理效果均不如本发明的50μM浓度的硝酸铈处理效果显著。
[0043] 对比例2-1、将实施例1步骤1)中黑暗培养的时间由18天改成20天,相应的将步骤2)的诱导时间由6天改成4天;其余等同于实施例1。
[0044] 对比例2-2、将实施例1步骤1)中的黑暗培养的时间由18天改成16天,相应的将步骤2)的诱导时间由6天改成8天;其余等同于实施例1。
[0045] 对比例3-1、将硝酸铈改成硝酸镍,浓度保持不变;其余等同于实施例1。
[0046] 对比例3-2、将5硝酸铈改成硫酸硒,浓度保持不变;其余等同于实施例1。
[0047] 将上述对比例2-1~对比例3-2所得的丹参毛状根按照实施例1所述方法进行隐丹参酮和二氢丹参酮I含量的检测,所得结果如下表2所述:
[0048] 表2
[0049]  隐丹参酮(mg/g) 二氢丹参酮I含量(mg/g)
对比例2-1 0.2 0.61
对比例2-2 0.22 0.65
对比例3-1 0.15 0.58
对比例3-2 0.18 0.67
实施例1 0.27 0.87
[0050] 最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。

附图说明

[0028] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0029] 图1为不同浓度的硝酸铈诱导处理时,二氢丹参酮I、隐丹参酮的成分含量对比图。
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