甲基-β-环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用   0    0

[0001] 本发明属于病毒学领域以及蛋白质表达系统领域，涉及甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，简称MβCD，也有表示为MBCD，Me-βCD，MeBCD)提高昆虫杆状病毒入侵效率，进而提高外源蛋白表达量的具体应用方法。

[0002] 杆状病毒是一类具有囊膜的双链DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。自Smith等人首次利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)作载体成功表达人β-干扰素以来，至今已用杆状病毒表达的蛋白有千种(Acharya A,Sriram S&Saehrawat S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus molecular biology and biotechnological applications for large-scale synthesis of recombinant proteins.Curr Sci 2002,83:455–465.)，目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有AcMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)，由于杆状病毒具有强大多角体启动子及P10启动子，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工，具有良好的生物学活性，而且其基因组可以插入较大片段外源DNA等，所以昆虫杆状病毒表达系统已被公认为是优良的真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物及疫苗已经上市，例如利用杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(CervarixTM，葛兰素史克)已经上市，并取得非常好的免疫效果。

[0003] 为了更好的利用杆状病毒表达外源蛋白，国内外许多学者致力于如何提高其表达量方面的研究：法国学者将病毒中组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和p10基因破坏以增加表达量(专利：改进的杆状病毒表达系统，公开号：103748229A)；美国科学家通过利用多种信号肽改变外源蛋白加工与分泌(专利：Method to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems.United States.Patent 5278050)以提高表达量。一系列经过改造的杆状病毒在应用中都需要通过重组病毒的繁殖、大量扩增环节，才能应用于外源蛋白的表达，在重组病毒制备及扩增过程中，需要消耗大量的人力财力，如果能在病毒感染的过程中，应用一定手段提高感染效率、进而提高其表达量，可节省人力物力，降低成本，达到事半功倍的效果。

[0004] MβCD，是β-环糊精(β-CD)的烷基化衍生物，白色粉末，无毒、无嗅、微甜，易溶于水和有机溶剂，在食品及药物中得到了广泛应用。谢伯泰等综述了MβCD在口服药、鼻腔喷雾剂、栓剂以及透皮吸收剂方面的应用前景，并且指出MβCD是毒性比较小的药物稳定剂、增溶剂及吸收促进剂，但要注意MβCD使用剂量，以保证其具有较好的安全性(谢伯泰,马晓明,姚孙贤,谢薇梅.甲基化-β-环糊精的特性及其在药物中的应用.中国新药杂志2009年第18卷第8期705-709.)。本课题组前期在研究杆状病毒入侵过程时发现MβCD在较高浓度下，可以抑制BmNPV感染BmN细胞，正是在运用一系列的连续浓度梯度MβCD研究抑制入侵的过程中，意外的发现当使用低浓度MβCD时，非但没有抑制病毒的感染，反而增强病毒的感染性，最终增加了杆状病毒的对外源蛋白的表达量。利用MβCD提高杆状病毒感染率及外源蛋白表达量方面还没有报道，所以本发明是首次对这种提高杆状病毒表达载体外源蛋白表达量的方法做具体报道。

[0005] 解决的技术问题：本发明的目的是提供一种化学药物——MβCD的新用途，提供应用一定浓度的甲基-β-环糊精提高杆状病毒外源蛋白表达量的新方法，该方法简便，成本低廉，易于操作推广。

[0006] 技术方案：甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量中的应用。

[0007] 所述昆虫杆状病毒为AcMNPV病毒或BmNPV病毒。

[0008] 所述表达系统为sf21、sf9或BmN细胞。

[0009] 所述表达系统为贴壁培养及悬浮培养的细胞。

[0010] 所述甲基-β-环糊精的工作浓度为0.125-2mM。

[0011] 甲基-β-环糊精在提高昆虫杆状病毒入侵宿主细胞的效率的应用。

[0012] 提高昆虫杆状病毒表达系统外源蛋白表达量的组合物，有效成分包括甲基-β-环糊精。

[0013] 1.MβCD(购自Sigma公司)溶液的配制及杆状病毒准备

[0014] 用1×PBS溶解MβCD，配制浓度为50～100mM的储存液备用。

[0015] 将重组杆状病毒感染敏感宿主细胞，感染后60-96h收获出芽病毒(Budded virus，BV)，用终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存用于后续研究。

[0016] 2.细胞的孵育

[0017] 将对数生长期的昆虫细胞接种到培养皿/板中，不同细胞株保持其最适密度，比如sf21和sf9保持在约5×104个细胞/cm2，BmN细胞约1×104个细胞/cm2，贴壁12-24h后，用配制好的MβCD储存液加入到贴壁昆虫细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.125～2mM，孵育10-120min，孵育细胞温度为24-29℃，以0mM MβCD(即等体积1×PBS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除(或者不去除)1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次。

[0018] 3.病毒感染效率分析及外源蛋白表达量分析

[0019] 接着用感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.01～50的杆状病毒感染相应的宿主细胞，感染60-120min后，除去病毒液，用无血清培养基轻轻洗涤细胞两次(也可不洗)，加入正常的培养基，感染后6h利用流式细胞仪分析被感染细胞中荧光表达效率，确定病毒感染效率。外源蛋白表达量分析则收集感染后24-120h细胞样品，检测细胞中表达的荧光素酶活性，比较不同处理间荧光素酶相对活性差异。

[0020] 有益效果：本发明首次发现MβCD的一种新用途。用一定浓度MβCD孵育用于表达外源蛋白的细胞，能显著的提高昆虫杆状病毒感染效率并提高外源蛋白的表达量。当用0.25mM MβCD孵育BmN细胞时，BmNPV病毒感染的细胞数量提高了35％左右，而荧光素酶的活性比对照提高了799％，其它浓度的增强效果也达到极显著水平；AcMNPV入侵效率提高了
51％。本发明公开的用途，可明显改善杆状病毒表达系统的表达效率，同时MβCD本身易溶于水和有机溶剂，已经广泛的应用于药品和食品行业，具有良好安全性，因此应用杆状病毒表达药用蛋白同样可以应用本方法。本发明提供的方法容易理解，操作简单易行，效果明显。

[0028] 以AcMNPV为例：

[0029] 用1×PBS(购自上海生工生物工程股份有限公司)溶解MβCD，配制浓度为50mM的储存液。

[0030] 为了便于观察及统计本发明所述的提高外源蛋白的表达效率，分别将hsp70操纵下的报告基因egfp和AcMNPV多角体基因启动子控制下的荧光素酶基因转座到AcMNPV Bac-to-Bac(Invitrogen)的Tn7转座插入位点，命名AcBac-egfp和AcBac-Luc，提取DNA，转染sf21，收获出芽病毒粒子(Budded Virus,BV)后，继续用于感染sf21细胞，72h后收获病毒，终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于本发明中涉及的实例。

[0031] 实施例1：分别用终浓度为0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM的MβCD处理后,AcBac-egfp感染率分析(MOI＝5)

[0032] 在24孔细胞培养板中各接种约1×105/孔的sf21细胞，贴壁后，将配制好的MβCD储存液加入到贴壁细胞sf21的细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0mM(等体积1×PBS，图1CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM。27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次(也可不洗)，接着用MOI＝5的AcBac-egfp病毒感染不同处理的细胞，27℃感染1h后移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍(也可不洗)，添加正常培养基，放置于27℃培养箱培养6h后，用流式细胞仪统计有荧光表达的细胞数量及总细胞数，利用excel t测验分析处理与对照组间是否存在显著性差异。实验设三个重复，并重复两次。图1是MOI＝5AcBac-egfp感染宿主昆虫细胞sf21示例的结果，统计结果显示0.125-2mM浓度的MβCD处理细胞相对感染率较对照均有显著的增加。

[0033] 实施例2：分别用终浓度为0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM的MβCD处理sf9后，AcBac-egfp感染率分析(MOI＝5)

[0034] 在24孔细胞培养板中各接种约1×105个/孔的sf9，贴壁后，用配制好的MβCD储存液加入到贴壁细胞sf9的细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0mM(等体积1×PBS，图1CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI＝5AcBac-egfp分别感染不同浓度MβCD孵育的细胞，27℃感染1h后，移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，添加常规培养基，放置于27℃培养箱培养6h后，用流式细胞仪统计有荧光表达的细胞数量及总细胞数，利用excel中t测验分析处理与对照组间是否存在显著性差异。实验设三个重复，并重复两次。图2是MOI＝1AcBac-egfp感染宿主昆虫细胞sf9示例的结果，统计结果表明用0.125-2mM浓度处理细胞后，表达荧光蛋白的细胞数量较对照均有极显著的提高。

[0035] 实施例3：不同浓度的MβCD对AcBac-Luc荧光素酶表达量影响(MOI＝5，感染后96h)[0036] 在24孔细胞培养板中各接种约1×105个/孔的sf21，贴壁后，用配制好的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM，等体积的1×PBS作为对照(即图3CTRL)，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用AcBac-Luc(MOI＝5)分别感染不同处理细胞，27℃感染1h后，移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入正常培养基，在感染后96h收集细胞检测荧光素酶活性，各个处理均设三个重复。样品收集时，首先去除培养基，用1×PBS洗两遍，再用500μL荧光素酶试剂盒(Promega)中裂解液裂解、收集MβCD处理及对照细胞，-80℃保存，直至120h后收集完所有样品，参照Promega产品指南所述方法用20/20n Luminometer(Promega公司)检测荧光素酶活性。细胞裂解混合物12000rpm 4℃离心5min，取上清进行10倍稀释，再取4μL稀释液与20μL底物混合，测定荧光素酶相对活性。图3是AcBac-Luc感染不同浓度药物处理sf21的结果，统计结果显示在0.25～2mM药物处理的细胞荧光素酶的活性极显著高于对照。

[0037] 实施例4.终浓度为0.25mM的MβCD处理后,AcBac-Luc感染后不同时间点荧光素酶活性分析(MOI＝5)

[0038] 在24孔细胞培养板中各接种约1×105个/孔的sf21，贴壁后，用配制好的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度为0.25mM，对照加入相应量的1×PBS(即图4CTRL)，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用AcBac-Luc分别感染MβCD及对照细胞(MOI＝5)，27℃感染1h后，移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入正常培养基，在感染后24h、48h、72h、96h、120h各时间点收集样品，各个处理均设三个重复。荧光素酶活性的测定见本发明实施例3。图4是AcMNPV感染sf21示例的结果，统计结果显示药物处理的细胞荧光素酶的活性显著高于对照(P<0.05)。

[0039] 以BmNPV为例：

[0040] BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[Huang JS  et al.Construction  of  the  Bac-to-Bac  System  of  Bombyx  mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225]。为了便于观察及统计本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因egfp和BmNPV多角体基因启动子操纵下的荧光素酶基因分别转座到BmBacJS13中Tn7转座插入位点，命名BmBac-egfp和BmBac-Luc，提取DNA，转染家蚕细胞，收获BV后，继续用于感染家蚕细胞，72h后收获病毒，终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于本发明中以下实例。

[0041] 实施例5：不同浓度MβCD处理BmN细胞后，表达绿色荧光蛋白细胞感染率比例调查[0042] 在24孔细胞培养板中各接种约5×104个/孔的BmN细胞，贴壁后，分别取不同量的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM，对照加入相应体积1×PBS，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用BmBac-egfp(MOI＝5)分别感染不同处理的细胞，27℃感染1h后，移去病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，添加常规培养基，放置于27℃培养箱培养6h后，流式细胞仪统计感染细胞数，t测验分析比较不同浓度MβCD对病毒感染效率影响。图5是BmBac-egfp感染BmN细胞示例的结果，统计结果显示0.125、0.25、0.5mM MβCD处理组都有显著的增强效果，感染效率比对照分别提高29％、35％、33％，达到极显著水平(P<0.01)，其它各处理也有一定增强效果。

[0043] 实施例6：MβCD(0.25mM)处理细胞时间与病毒感染率关系

[0044] 在24孔细胞培养板中各接种约5×104个/孔的BmN细胞，贴壁后，加入MβCD储存液使终浓度为0.25mM，对照加入1×PBS，27℃分别孵育10、30、45、60、90、120min。然后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用BmBac-egfp感染细胞(MOI＝5)，27℃感染1h后去掉病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27℃培养箱培养6h后，流式细胞仪统计荧光细胞数量，t测验分析MβCD孵育时间对病毒感染效率的影响。实验设三个重复。图6是BmBac-egfp感染MβCD孵育BmN不同时间示例的结果。统计显示MβCD处理细胞10min以上即有较好的增强效果，10-120分钟处理均显著高于对照。

[0045] 实施例7：不同浓度MβCD对不同感染剂量病毒感染细胞中表达的荧光素酶表活性影响

[0046] 在24孔细胞培养板中各接种约5×104个/孔的BmN细胞，贴壁后，分别取配制好的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度分别0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM，对照加入相应体积1×PBS，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用病毒BmBac-Luc(MOI＝1及MOI＝0.1)感染细胞，27℃感染1h后去除病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27℃培养箱培养24h后测定细胞中荧光素酶活性，检测方法见本发明实施例3。实验设三个重复。图7是BmBac-Luc感染BmN细胞示例的结果，统计结果表明不同浓度MβCD处理细胞均可以提高荧光素酶表达量，以0.25mM处理效果最为明显，在用MOI＝1剂量感染中，处理比对照的活性提高了799％，达到极显著水平，其它处理也都达到极显著水平(P<0.01)；在用MOI＝0.1剂量感染中与处理比对照的活性提高了532％，达到极显著水平(P<0.01)，其它不同剂量病毒感染都达到显著(0.125mM，P<0.05)与极显著效果(P<0.01)。

[0047] 最后应当说明的是：以上所述的实施例和实施方式中所述MβCD浓度和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态，培养方式(悬浮培养及贴壁培养)，细胞培养基种类(TC100，Grace's，SF900II SFM，Express SFM等)、培养基理化性质等(比如酸碱度等)微小的差异，以及细胞类型(如Hi5等)，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，并被包括在本申请的精神和范围之内；同时也包含其它杆状病毒及在病毒入侵中依赖于胆固醇的其它囊膜病毒，也被包括在本申请的精神和范围之内。

[0021] 图1.不同浓度MβCD预处理sf21细胞对AcMNPV病毒感染率分析图。分别用终浓度为0mM(等体积的1×PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM的MβCD处理30min后，再用AcBac-egfp感染(MOI＝5)1h，去除感染液后正常培养。6h后用流式细胞仪检测细胞相对感染率，其中CTRL感染率设为100％，其他各处理相对感染率如图所示，*表示与对照相比较差异显著(P<0.05)，**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0022] 图2.不同浓度MβCD预处理sf9细胞对AcMNPV病毒感染率分析图。分别用终浓度为0mM(等体积的1×PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.5mM、2mM的MβCD处理sf9细胞30min后，用AcBac-egfp感染(MOI＝5)1h，去除感染液后正常培养，6h后用流式细胞仪检测细胞感染率。**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0023] 图3.不同浓度的MβCD对AcMNPV病毒外源蛋白表达量影响示意图(感染后96h)。分别用终浓度为0mM(等体积的1×PBS作为对照，CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM MβCD处理sf21 30min后，接着用AcBac-Luc(MOI＝5)分别感染不同处理细胞1h，去除感染液后正常培养，在感染后96h收集细胞检测荧光素酶活性。**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0024] 图4.0.25mM的MβCD处理细胞，AcMNPV表达荧光素酶的时相分析图(MOI＝5)。用0.25mM MβCD孵育sf21细胞30min后，用AcBac-Luc分别感染MβCD及对照细胞(MOI＝5)，27℃感染1h后，移去病毒液，在感染后24h、48h、72h、96h、120h各时间点收集样品，检测分析荧光素酶相对活性。*表示与对照相比较差异显著(P<0.05)，**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0025] 图5.不同浓度MβCD处理BmN细胞后对BmNPV感染率分析图。使用MβCD终浓度分别为0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM，对照加入相应体积1×PBS，27℃孵育30min后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍后用BmBac-egfp(MOI＝5)27℃感染1h，移去病毒液，清洗两遍，放置于27℃培养箱培养6h后，流式细胞仪统计感染细胞数。**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0026] 图6.MβCD(0.25mM)孵育细胞时间对BmNPV感染率影响示意图。终浓度为0.25mM MβCD 27℃分别孵育10、30、45、60、90、120min，对照加入相应体积1×PBS。然后去除孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用BmBac-egfp感染细胞(MOI＝5)，27℃感染1h后去掉病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27℃培养箱培养6h后，流式细胞仪统计荧光细胞数量。*表示与对照相比较差异显著(P<0.05)，**表示与对照相比较差异极显著(P<0.01)。

[0027] 图7.不同浓度MβCD对BmNPV病毒(不同感染剂量)表达的荧光素酶活性影响示意图。使用0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM MβCD终浓度27℃孵育BmN细胞30min，对照加入相应体积1×PBS，后去除孵育液冲洗细胞2次，用病毒BmBac-Luc(MOI＝1及MOI＝0.1)感染BmN细胞，27℃感染1h后去除病毒液，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27℃培养箱培养24h后测定细胞中荧光素酶活性。深灰色柱状图为MOI＝1感染剂量，**表示各处理与对照达到极显著水平(P<0.01)；浅灰色为MOI＝0.1感染剂量，表示处理与对照达到显著水平(P<0.05)， 表示各处理与对照达到极显著水平(P<0.01)。