一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法   0    0

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法。

[0002] 猪细小病毒( Porcine parvovirus, PPV)是一种自主复制型病毒，是引起母猪产畸形胎的主要因素之一，通常初产母猪感染PPV之后可引起繁殖障碍，主要表现为流产、不孕、产死胎和木乃伊胎等，给养猪业带来重大的经济损失。PPV、猪圆环病毒( PCV) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)一直是猪病研究的热点，最近研究发现PPV在猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中扮演着重要角色。

[0003] PPV基因组为单链线状DNA分子，大小约为5000个核苷酸，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA 基因组。研究发现，PPV同细小病毒属的其他细小病毒的基因组有很高的同源性。此外，PPV 的基因组结构与其他细小病毒相似，两端有发夹结构，3′端有一个102 bp的回文序列折叠形成的“Y”字型发夹结构；5′端有一个127 bp的回文序列、中间被一个24 bp的短回文序列中断并折叠形成的“U”字形发夹结构,这种末端结构对其复制是非常重要的。基因组有2个开放阅读框架(ORF)，5′端的ORF1编码非结构蛋白(即调节蛋白)，3′端的ORF2编码结构蛋白，结构蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。由启动子P4开始转录的NS基因编码3种非结构蛋白NS1、NS2和NS3；由启动子P40开始转录翻译3 种结构蛋白VP1、VP2和VP3,它们的分子质量分别约为83、64、60ku。

[0004] 目前市场上防制PPV的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。在临床应用中发现灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险，很难在实践中推广应用。故传统疫苗在防制PPV中暴露出越来越多的问题，一种新型既安全又可靠的基因工程疫苗迫在眉睫。

[0005] VP2是构成PPV衣壳蛋白的主要成分，也是中和抗体作用的靶蛋白,含有病毒的主要抗原决定簇，还具有血凝活性。VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子（VLPs），能诱导很强的免疫应答。赵俊龙等研究发现PPV VP2 在60-68,81-88,266-275,351-357和398-404氨基酸处存在抗原位点的优势区域。梁秀丽等发现VP2 蛋白较有可能成为B细胞表位的区段位于N 端第10-18、34- 39、94-103、121-126、137-144、156-165 和209-214 区段。Soren K等学者分析了PPV的抗原结构，发现有9个线性表位均位于VP2中，只有VP2 N端表位能诱导病毒中和抗体，用哺乳动物细胞系表达或用杆状病毒表达时VP2蛋白可形成VLPs。从分离纯化的病毒粒子电镜图中可以找到两种形态的病毒粒子：一种为完整病毒粒子，内含PPV ssDNA；另一种为病毒空衣壳，内无DNA，病毒空衣壳中VP2含量最高，这种“空芯”病毒粒子仍具有很好的免疫原性。2007年，Yi G X等用重组乳酸菌表达了VP2蛋白，其表现出很好的免疫原性。基于上述特点，VP2成为PPV在诊断和免疫学研究方面的热点。

[0006] 本发明的目的在于根据巴斯德毕赤酵母中高效表达猪细小病毒主要结构蛋白VP2基因，所以以此高表达量的结构蛋白为基础，提供了猪细小病毒基因工程疫苗。

[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

[0008] 1. 构建重组酵母表达载体：在GenBank上面查找国际标准弱毒株猪细小病毒VP2基因，序列号：NC-001718，表达载体为pGAPZαA，宿主菌为酵母菌株SMD1168（购自Invitrogen公司），构建pGAPZαA-VP2重组酵母表达载体。PCR扩增出PPV VP2全基因序列，上游引物P1如SEQ ID NO:1所示，下游引物P2如SEQ ID NO:2所示，酶切位点为XhoⅠ和NotⅠ，AAAAGA为Kex2蛋白酶切位点。

[0009] 2. 构建重组酵母工程菌：将其线性化电击转化巴斯德毕赤酵母，构建表达工程菌。将感受态P.pastoris SMD1168 100μL与经AvrⅡ线性化的pGAPZαA-VP2 10 μg相混合，冰浴5min，300V、200Ω电击15ms，然后迅速加入1ml 1M的山梨醇，将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板（含100 mg/ml Zeocin）上，将平板倒置，于30℃培养至单菌落出现，培养2~3 d。采用煮-冻-煮法制备PCR 模板分析P.pastoris 转化子。再经不同浓度Zeocin 的YPDS平板筛选高拷贝转化子，用于高效表达目的蛋白。

[0010] 3. 重组酵母工程菌的非诱导表达：用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin 抗性的单菌落，于5mL 的YPD 液体培养基中进行一级培养，30℃，200 r/min 振荡过夜，至OD600=2-6，即细胞处于对数生长期。取1mL一级培养液，重悬于50mL 的YPD 中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时。

[0011] 4. 表达蛋白的纯化：培养约72小时的培养物低速离心收集上清，用膜系统等方法纯化蛋白。

[0012] 5. PPV基因工程疫苗的制备：对上诉表达上清进行SDS-PAGE和Western Blot分析，然后将青霉素、链霉素与分离纯化的蛋白混合，再加入进口的纳米佐剂同生理盐水或PBS混合，将混合物PH值调至生理值，即PH7.0-7.5，即制备了猪细小病毒基因工程疫苗。

[0013] 由于PPV VP2蛋白对密码子的偏好性与巴斯德毕赤酵母表达系统对密码子的偏好性差异最小，故选择毕赤酵母表达系统，且其对表达外源蛋白十分有利， (1)高稳定：该系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合到酵母染色体上，故构建的菌株十分稳定；(2)高分泌：巴斯德毕赤酵母表达系统中的α-因子信号肽的分子生物学特性研究的十分清楚，加之它自身的生物学特性，其分泌表达可达1g/L，这在已知的分泌表达系统中十分少见；(3)成本低：重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达比在昆虫和哺乳动物中表达成本要低，培养基不需要像牛血清白蛋白那样昂贵的添加物，也不需要二氧化碳培养箱和组织培养箱等昂贵的设备；(4)容易放大：重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达已在1000 L发酵罐中实现了工业化生产。

[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0015] 本发明重组酵母菌表达的目的蛋白很高，而且目的蛋白分泌到培养基中，而酵母菌自身表达的蛋白由于没有信号肽无法分泌到培养基中，故表达上清中几乎无杂蛋白（见附图1），且酵母菌株SMD1168属于蛋白酶缺陷型菌株，防止了目的蛋白降解；由于表达载体pGAPZαA含有α-因子信号肽，易于表达产物分泌到培养基中，从而更容易分离纯化目的蛋白，避免了由于酵母细胞壁较牢固难破碎来获取并纯化蛋白的难题，且在PPV VP2蛋白N端引入Kex2蛋白酶，以保证其形成天然N端，从而保证了VP2蛋白的生物学活性。

[0016] PPV VP2的密码子与大肠杆菌、酵母菌、人的密码子偏爱性差异分析发现，VP2密码子与酵母密码子偏爱性的差异最小，故选择酵母表达系统优化表达以提高表达量，且国内未见VP2在酵母中表达相关报道，本发明VP2蛋白表达量高达595.76mg/L（见实施例3），明显优于其他表达系统。

[0017] 本发明选择的酵母表达载体pGAPZαA是一种非诱导组成型分泌表达载体，含有3-磷酸甘油醛脱氢酶强启动子，优于其他启动子，表达量更高，重要的是不需要甲醇诱导，防止了甲醇的危险及其对酵母细胞的毒副作用。

[0018] 本发明从碳源和氮源对发酵条件进行了初步探索，从成本和表达量两因素研究发现，以葡萄糖作为碳源优于甘油，以尿素作为氮源优于胰蛋白胨和硫酸铵，间歇性地流加以补充碳源和氮源更有利于酵母细胞的生长；且在发酵过程中发酵罐中的溶氧量对酵母生长以及表达量的提高起着举足轻重的作用，特别是发酵第三天，溶氧量要求更高，同时保证发酵液PH值在5.5-6.0之间。

[0022] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

[0023] 实施例1

[0024] 1.构建重组酵母表达载体：表达载体为pGAPZαA，宿主菌为酵母菌株SMD1168。PCR扩增出PPV VP2全基因序列，上游引物P1如SEQ ID NO:1所示，下游引物P2如SEQ ID NO:2所示，酶切位点为XhoⅠ和NotⅠ，AAAAGA为Kex2蛋白酶切位点。

[0025] 2.构建重组酵母工程菌：以上述构建好的重组酵母表达载体线性化电击转化酵母菌株SMD1168，线性化酶为AvrⅡ。

[0026] 3.重组酵母工程菌的非诱导表达：用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin 抗性的单菌落，于5mL 的YPD 液体培养基中进行一级培养，30℃，200 r/min 振荡过夜，至OD600=2-6，即细胞处于对数生长期。取1mL一级培养液，重悬于50mL 的YPD 中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时。

[0027] 4.表达蛋白的纯化：培养约72小时的培养物低速离心收集上清，用膜系统等方法纯化蛋白。

[0028] 5.PPV基因工程疫苗的制备：对上诉表达上清进行SDS-PAGE和Western Blot分析（图1~2），然后将青霉素、链霉素与分离纯化的蛋白混合，再加入佐剂同生理盐水或PBS混合，将混合物PH值调至生理值，即PH7.0-7.5，即制备了猪细小病毒基因工程疫苗。佐剂选用进口纳米佐剂。

[0029] 实施例2

[0030] 动物实验：将上述制备的PPV基因工程疫苗免疫体重基本无差异、精神状况良好PPV阴性的仔猪，同时设阳性对照、空载体对照、生理盐水对照、佐剂对照以及不做任何处理的空白对照，15天后加强免疫，经ELISA试剂盒检测产生抗体后，使用猪细小病毒强毒株进行攻毒实验（F组除外），以检测所产生的抗体有没有保护力。实验如下：

[0031]试验组 接种物 剂量
A组 PPV基因工程疫苗 3头份
B组 阳性对照（PPV弱毒苗） 3头份
C组 空载体对照 3头份
D组 生理盐水对照 3头份
E组 佐剂对照 3头份
F组 不做任何处理的空白对照

[0032] 结果：15天后加强免疫，经ELISA试剂盒检测，A组和B组产生抗体，且抗体效价很高，而C组、D组、E组和F组并未检测到抗体。使用PPV强毒株攻毒前称体重，做差异显著性分析，五组与F组比较，差异不显著。攻毒后均在7天内出现发热症状，A、B组发热时间为2-5天左右，随后消失，与F组对比表现无异常。C组、D组和E组逐渐出现轻度至中度的发热、腹泻、关节炎及皮炎等症状，表现食欲不振、精神沉郁并且生长迟缓，有些甚至发展为僵猪，个别猪因多系统衰竭而死。试验结果表明，猪细小病毒基因工程疫苗足以对猪细小病毒病进行保护，甚至强于PPV弱毒苗。故由此推断，PPV主要结构蛋白制备的猪细小病毒基因工程疫苗可以有效防控猪细小病毒病的感染。

[0033] 实施例3

[0034] PPV VP2表达量测定：VP2表达上清蛋白浓度测定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，由于表达上清中存在少量的菌体蛋白，故测定的浓度为总蛋白浓度，具体步骤如下：

[0035] 1.完全溶解蛋白标准品BSA（5mg/mL），取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。用PBS稀释标准品。

[0036] 2.将稀释后的标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS稀释液补足到20μL。

[0037] 3.分别将VP2表达时间为48h、72h、96h的上清10μL加到96孔板的样品孔中，加PBS稀释液至20μL。

[0038] 4.各孔加入200μL G250染色液，室温放置3-5分钟。

[0039] 5.用酶标仪测定波长为595nm的吸光度。

[0040] 6.根据标准曲线计算出VP2不同表达时间上清中的蛋白浓度。

[0041] 上述方法测定的浓度为上清中的总蛋白浓度，再根据光密度扫描仪扫描SDS-PAGE胶中目的条带VP2蛋白占总蛋白的百分比，即可算出VP2在不同时间的表达量。

[0042] 结果：根据标准蛋白BSA在不同浓度下的OD595值，以蛋白浓度为X轴，OD值为Y轴，制作标准蛋白浓度曲线，见附图3.再用EXCEL表格根据标准浓度曲线制作趋势线，其中相关度R2高达95.41%，趋势线函数关系式为：y=1.465x+0.6341.VP2蛋白在48h、72h、96h表达上清的OD595值分别为0.9479、1.0851、1.0310，经光密度扫描仪扫描VP2蛋白占总蛋白百分比为96.77﹪，再根据趋势线函数关系式即可算出PPV VP2在48h、72h、96h表达量分别为414.56mg/L、595.76mg/L、524.28mg/L，由此确定最佳表达时间为72h，即确定了PPV VP2大规模发酵的培养时间。

[0019] 图1是PPV VP2蛋白SDS-PAGE分析，1：未经浓缩pGAPZαA-VP2表达上清；2：pGAPZαA空载体表达上清；M：预染蛋白分子量Marker；

[0020] 图2是PPV VP2蛋白 Western Blot分析，1,2：未经浓缩pGAPZαA-VP2表达上清；M：预染蛋白分子量Marker；3：pGAPZαA空载体表达上清。

[0021] 图3是实施例3中PPV VP2蛋白浓度测定制作的标准蛋白BSA浓度曲线。