[0039] 弗氏完全佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(HRP标记的羊抗兔IgG)、牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0040] 其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
[0041] 本发明涉及到的各溶液的制备方法为:
[0042] PBS溶液(0.01mol/L pH=7.4):称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H200.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
[0043] PBST溶液(0.01mol/L pH=7.4):在1000mL PBS中加入500μL Tween-20,混合均匀。
[0044] 包被缓冲液CB(0.05mol/L pH=9.6):称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
[0045] 1wt%酪蛋白溶液:其为封闭液,称取0.01g酪蛋白溶解于1mL PBS中,混合均匀。
[0046] 邻苯二胺底物液:称取1.85g Na2HPO4·12H2O、0.51g C6H8O7溶解于蒸馏水中并定容至50mL,称取4mg邻苯二胺溶于10mL上述溶液中,临用前加入15μL30%H2O2;
[0047] 终止液:2mol/L H2SO4。
[0048] MES缓冲液(0.1M,pH=5.5):称0.1921g MES溶解于10mL蒸馏水中,用NaOH溶液调节其pH至5.5。
[0049] 实施例1
[0050] 一种叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的定量检测方法,所述方法包括以下步骤:
[0051] a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备
[0052] a-1、称取10mg SiO2-FO溶于1mL PBS溶液中,磁力搅拌1h即得到浓度为10mg/mL的SiO2-FO溶液;
[0053] a-2、称取10mg OVA溶于2mL PBS中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液,混合均匀后再滴加90μL 25%戊二醛溶液,25℃下避光搅拌4h;将反应液置于截留分子量为8000-12000Da的透析袋中,用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO包被抗原,其浓度为
3.33mg/mL,4℃储存待用;
[0054] a-3、称取10mg BSA溶于2mL PBS中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液,混合均匀后再滴加90μL 25%戊二醛溶液,25℃下避光搅拌4h;将反应液置于截留分子量为8000-12000Da透析袋中,用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO免疫原,其浓度为3.33mg/mL,4℃储存待用。
[0055] 所述步骤a-1中的SiO2-FO(叶酸功能化二氧化硅)的制备方法为:
[0056] a-1-1、氨基功能化二氧化硅(SiO2–NH2)的制备
[0057] 将380μL正硅酸乙酯和12mL无水乙醇混合搅拌0.5h;加入570μL 26%氨水,25℃下搅拌24h;再加入400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷,25℃下持续搅拌24h;将反应液10000rpm/min离心分离20min,取沉淀用无水乙醇洗涤,并在25℃下干燥24h即可得到氨基功能化二氧化硅;
[0058] a-1-2、叶酸功能化二氧化硅(SiO2–FO)的制备
[0059] 称取57.5mg叶酸溶于2mL MES缓冲液,再加入40.3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺,室温下搅拌1h;
[0060] 称取100mg SiO2–NH2溶于5mL MES缓冲液后加入到上述混合液中,25℃下避光搅拌24h;将反应液10000rpm/min离心分离10min,取沉淀用蒸馏水和无水乙醇洗涤,并在25℃下干燥24h即可得到叶酸功能化二氧化硅。
[0061] b、抗SiO2-FO抗体的制备
[0062] 选用4只体重为2~2.5kg的雄性新西兰大白兔为免疫对象,实验之前首先将购买的新西兰大白兔饲养2周左右,维持其健康状态,其中3只作为免疫对象,第4只作为空白对照,空白对照组不进行任何免疫。
[0063] b-1、首次免疫:将SiO2-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后,采用背部皮下多点注射的方式注射到3只实验兔体内,注射8~10个点,注射量为1mL/只;免疫接种的方式有注射免疫、口服免疫、气雾免疫等,其中注射免疫又有皮下注射、皮内注射、肌肉注射静脉注射等方式,背部皮下注射操作方便,药物扩散较慢,有利于刺激机体产生免疫应答,继而产生抗体;而雄兔作为免疫对象可以避免其生理周期对实验产生影响。
[0064] b-2、加强免疫:首次免疫三周后进行加强免疫。将SiO2-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后,采取同样的方式注射到3只实验兔体内,注射8~10个点,注射量为1mL/只;此后每两周进行再次加强免疫,中间周进行耳静脉采血测血清效价,直到效价达到1:64000,再进行最后一次加强免疫,并在免疫一周后从动物颈动脉采血,静置析出抗血清并进行纯化,得到抗SiO2-FO抗体,其浓度为8.50mg/mL。
[0065] 弗氏不完全佐剂的制备方法为:称取50g的无水羊毛脂,量取100mL的液体石蜡混合,超声仪多次超声,每次不超过20min,防止超声过程中温度过高,不能及时散热,超声使之混合均匀,直到将该混合液体滴到水中并且半分钟内不扩散为止,得到的油状液体即为弗氏不完全佐剂,4℃冰箱储存待用。
[0066] 抗体效价鉴定的具体方法为:用包被缓冲液CB将包被抗原稀释400倍,包被在96孔酶标板上,4℃冰箱过夜;甩干,用PBST溶液洗3次,每次3min,每孔加200μL 1wt%酪蛋白封闭液,37℃封闭1h;甩干,PBST洗3次,每次3min,每孔加入100μL用PBS稀释成不同浓度的抗血清,其稀释比为1/1000~1/128000,37℃温育2h;甩干,PBST洗3次,每次3min,每孔加入100μL用PBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃温育2h;甩干,PBST洗3次,每次3min,每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应,37℃温育0.5h;每孔再加入50μL2mol/L H2SO4终止反应;最后用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值A。比较实验组与空白对照组在同一抗血清稀释倍数下的吸光值A,当A实验组≥2倍A空白组时对应的最大稀释倍数即抗血清的效价。
[0067] c、利用纯化好的抗SiO2-FO抗体和SiO2-FO包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析实验,在最优条件下建立标准曲线从而达到定量检测SiO2-FO的目的。
[0068] c-1、包被:用包被缓冲液将SiO2-FO包被抗原稀释1000倍,包被96孔酶标板。每孔100μL,4℃冰箱过夜;
[0069] c-2、封闭:甩干,PBST洗涤3次,每次3min,洗去未被结合上的SiO2-FO包被抗原,加入1wt%酪蛋白,每孔200μL进行封闭(减少非特异性吸附),37℃烘箱温育1h;
[0070] c-3、加样竞争:甩干,PBST溶液洗涤3次,每次3min,洗去多余的封闭液。将50μL浓2 3 4
度分别为0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、10 ng/mL的SiO2-FO标准品依次加入到酶标板的各行中,即每个浓度梯度重复三次,然后向各孔中加入50μL抗SiO2-FO抗体使之发生竞争反应,37℃烘箱温育3h;
[0071] 不同浓度的SiO2-FO标准品的制备方法为:用0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液将SiO2-FO稀释到指定的浓度。
[0072] c-4、加酶:甩干,PBST溶液洗涤3次,每次3min。每孔加入100μL PBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体,37℃烘箱温育3.5h;
[0073] c-5、显色:甩干,PBST洗涤3次,每次3min,洗去未被结合的二抗。每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应,37℃烘箱温育0.5h;
[0074] c-6、终止:每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应,用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值,同一浓度梯度的取平均值计算吸光度值。
[0075] d、以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。制得的标准曲线如图1所示,标准曲线的线性方程为A=0.8535-0.1083logC,其中A为490nm处的吸光度值,C为SiO2-FO浓度。其相关系数R=-0.9994,线性范围为10-2-104ng/mL,检出限为0.006ng/mL。
[0076] e、重复以上各步骤,只是将步骤(3)中的不同浓度的SiO2-FO标准品替换为未知浓度的SiO2-FO待测液,然后用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值,求取平均吸光度值。根据上述标准曲线的线性方程A=0.8535-0.1083logC,即可计算出SiO2-FO待测液的浓度。
[0077] 以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法,此方法所得到的标准曲线的线性关系最好,线性范围最宽。
[0078] 上述参照实施例对一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。