[0025] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0026] 一、具体实施例1
[0027] 本发明一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群，在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；在冬瓜熟腌的早期，优势菌则转变为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；在冬瓜熟腌的中期，优势菌属变为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；在冬瓜熟腌的后期，优势菌为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。确定优势菌群的具体过程如下：
[0028] 1、冬瓜熟腌
[0029] 冬瓜的熟腌按传统熟腌工艺进行。将新鲜的冬瓜清洗干净后，称重、去皮、去子瓤。然后切成边长8㎝左右的方块，放入沸水中煮至6～8分熟，捞出。将捞出的冬瓜在清水中浸泡一天，然后按照12.5千克冬瓜加0.8千克食盐的比例加入食盐，加盐的时候要将冬瓜块的六个面都抹上食盐，以面对面、背对背的方式放入坛中。最后用塑料纸封口，放于阴凉处发酵20天即可。
[0030] 2、样品总DNA提取纯化
[0031] 采用Fast DNA SPIN Kit试剂盒（MP Biomedicals，美国），按说明书上步骤，分别取熟腌冬瓜0天、5天、10天、15天、20天的腌制冬瓜卤水样品50ml进行总DNA的提取，提取过程如下：
[0032] （1）取冬瓜腌制卤水样品约200mL，记为样品1-5，无菌纱布过滤后，10000rpm，4℃离心5min，弃上清，沥干；
[0033] （2）在管中加入978ul磷酸盐缓冲液和122 ul MT缓冲液；
[0034] （3）用混凝器震荡混匀10 min，12000rpm离心1min；
[0035] （4）取上清液到干净的1.5ml 的离心管中，加入250ul pps缓冲液至上清液中反复用手颠倒10次左右进行混匀后，1200rpm 离心5min；
[0036] （5）将上清液转移到两个干净的离心管中，在每管中加入45ml 混匀的binding Mattix，反复颠倒，持续混匀2 min；
[0037] （6）取步骤（5）得到的混合物600ul，转移到SpinTMFilter中，10000 rpm 离心TM1min，倒掉下层液体，把剩余混合物依旧加入Spin Filter中，再次10000 rpm，离心1min，直到混合物离心完为止；
[0038] （7）加入500ulSEWS-M溶液到SpinTMFilter，用枪头轻轻吹打使其悬浮，12000 rpm 离心1min，去除滤液，12000rpm离心2min，弃去Catch Tube（用于旋转过滤用的试管），换一个干净的Catch Tube室温干燥5min；
[0039] （8）在Catch Tube中加入120ul DES并混匀，55℃水浴5min，水浴2-3min时轻轻吹打一次，以此来提高DNA的洗脱率；
[0040] （9）水浴后，将Catch Tube12000rpm离心1min，收集到的滤液即为样品DNA；
[0041] （10）在1%的琼脂糖凝胶电泳检测，－20℃冷藏备用。
[0042] 3、 PCR扩增
[0043] PCR扩增所用的反应体系为：10×Buffer 5μL、25 mmol/L的MgCl25μL、2.5mmol/L的dNTP8μL、10μmol/L的生腌冬瓜总DNA PCR扩增上下游引物各1.0μL ，具体为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）、模板DNA1.0μL、5U/μL的Ex-TaqDNA聚合酶0.4μL，用灭菌双蒸水补足50μL体系。PCR反应的循环条件为95℃预变性3min, 30个循环（94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸1min30s），72℃最后延伸10min。PCR产物采用纯化试剂盒切胶纯化。
[0044] 4、PCR产物的纯化
[0045] UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收DNA目的片段步骤：
[0046] （1）通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5mL离心管中。判定DNA片段位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。切胶时应尽可能减少胶的体积；
[0047] （2）称量凝胶的重量，以1mg=1μL换算凝胶的体积。每100mg凝胶中加入300μL Binding BufferⅡ；
[0048] （3）置于50-60℃水浴中10min，使胶彻底融化。加热融胶时，每2min混匀一次。(当所要回收的DNA片段小于500bp时，需要在溶胶后，另外再加入2倍胶体积的100%的异丙醇混匀)；
[0049] （4）将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，12000rpm室温离心1min。(如果溶胶后的总体积大于700μL，可以加样2次以上进行分别离心。)
[0050] （5）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL Wash Solution，12000rpm室温离心1min；
[0051] （6）重复步骤5一次；
[0052] （7）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心1min。(将离心后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5min，或自然晾干10min，有助于酒精的挥发，提高DNA的洗脱效率)
[0053] （8）将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中，在柱子膜中央加40μL Elution Buffer（洗脱液）放置5min。(将Elution Buffer加热到60℃或者直接将Elution Buffer加入到UNIQ-10柱中后60℃温育5min，有助于提高DNA的洗脱效率；也可以用双蒸水，用1M的NaOH将pH调节到8.5后，再60℃洗脱)
[0054] （9）12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
[0055] 5、连接转化
[0056] 将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体试剂盒（大连宝生物公司,产品货号：D101A）在4℃过夜连接，连接体系如下所示， pMD18-T vector:0.5µL；SolutionⅠ:2.5µL；PCR回收产物:2µL。然后转化感受态细胞E. coli DH5α中，涂板。转化过程如下：
[0057] （1）将连接产物吸到100µL感受态细胞中，温和混匀，置于冰上30min。
[0058] （2）42℃热休克90s，迅速放回冰中，将细胞冷却1-2min后，加入800µL LB培养基，37℃、125rpm振荡培养细菌45-90min。
[0059] （3）4000rpm离心1min，沉淀菌体，吸去上清液，留250µL左右转化混合物铺于+LB(Amp)琼脂平板上，室温下放置20-30min，待溶液完全被琼脂吸收后，倒置平皿37℃培养
12-16h。
[0060] （4）随机挑取单菌落作PCR进行初步检测，并振荡培养。
[0061] 6、转化子的筛选
[0062] 对转化子的筛选采用了蓝白斑及PCR的方法，PCR直接以白斑菌落为模板，采用能与T-载体插入点两侧特异结合的M13通用引物进行检测。
[0063] PCR扩增采用引物为：M13+(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)及M13-(5’-AGCGGATAACAATTTCACACGA-3’)（M13通用引物为现有技术）。
[0064] PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1.5μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向 引物(10μmol/L)0.5μL，DNA聚合 酶(5U/μL)0.2μL，MgCl2(25mmol/L)2.5μL，模板DNA 1.0μL，用超纯水补足反应总体积至25μL。
[0065] PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，32个循环(94℃变性50s,56℃退火50s,72℃延伸1min20s)，72℃最终延伸10 min。扩增完毕后，于1%的琼脂糖凝胶上电泳。
[0066] 7、基因序列的鉴别
[0067] 测序结果采用DAMBE、DNAstar、MEGA4.1等软件进行编辑分析，并把编辑好的序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，分析出克隆所属物种的系统位置和与之最近似的种类，即得到冬瓜熟腌过程中各个阶段的优势菌群。
[0068] 8、冬瓜熟腌体系腌制过程中优势菌群的分析
[0069] 将来自冬瓜熟腌体系不同腌制过程中阳性克隆子的测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，检测出腌制过程中共涉及到9个不同的菌属，其中以不动杆菌属、乳杆菌属和魏斯氏菌属的变化最为明显。5个时期的克隆子与GenBank数据库中已知细菌的16S rDNA序列相似性范围在90%以上；冬瓜熟腌体系中不同腌制时期样品的细菌群落测定结果如表1所示。
[0070] 表1 16S rDNA克隆文库法对腌制冬瓜样品的细菌群落组成分析结果
[0071]
[0072] 由表1可知，在冬瓜熟腌的第0天时（即清水浸泡结束后取样），腌制体系中的优势细菌为4个不同的菌属，即不动杆菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属。不动杆菌属细菌，占克隆子总数的40%，其中又以醋酸钙不动杆菌占绝对优势；魏斯氏菌属占17.5%，芽孢杆菌属占25%，肠杆菌占10%；其他菌属细菌仅占7.5%。在第5天，魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属成为优势菌属，分别占总数的37.5%、35%和25%；其他菌属的细菌占2.5%。到第10天时，优势菌属变为乳杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属，分别占55%、12.5%和32.5%。第15天和20天的菌群结构相似，优势菌属为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属，魏斯氏菌比列分别为70%、67.5%，而芽胞杆菌则为15%、20%，葡萄球菌则各占15%和12.5%。
[0073] 0天微生物的种类比较丰富，主要是因为那时还没有加盐腌制，只是用清水浸泡，所以比较适合细菌的生长。0天时腌制体系中的优势细菌有4个不同的菌属，分别为不动杆菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属。其中又以不动杆菌属中的醋酸钙不动杆菌的量最多。醋酸钙不动杆菌是能引起败血症、泌尿道感染的病原菌，对临床常用抗生素耐药性极强。同时醋酸钙不动杆菌对去除水体中的总氮、总磷有一定的效果。
[0074] 在第5天，魏斯氏菌和芽孢杆菌占到了绝对优势。可能是由于样品中加入较多的盐后，不耐盐的微生物被很快杀死或抑制，而耐盐的微生物成为了发酵过程中的主导细菌。到第10天时，优势菌属变成了乳杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属，其中弯曲乳杆菌数量最多，占52.5%。弯曲乳杆菌由于其生长速度快、产酸能力强。而低pH条件杀死或抑制了不耐酸微生物的生长，而弯曲乳杆菌的数量也随着pH值的降低而减少。到第15天和20天时，魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属成为优势菌属，其中类肠膜明串珠菌占优势，此与先前研究发现的在冬瓜腌制后期的优势微生物为类肠膜明串珠菌相似。在冬瓜腌制的过程中芽孢杆菌一直都是优势菌，而袁晓阳、陆胜民等也从腌冬瓜中分离出了芽孢杆菌，这可能其较耐酸耐盐以及非厌氧发酵条件有关。
[0075] 二、具体实施例2
[0076] 一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，该优势菌为类肠膜明串珠菌，该类肠膜明串珠菌的上游引物为5′-GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA-3′，下游引物为5′-AACCATGCGGTTGTTGGTA-3′。该引物的设计中注重与冬瓜熟腌过程中出现的优势菌群相区分，如：不动杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属或葡萄球菌属的细菌；由引物验证试验结果图5可见类肠膜明串珠菌的上下游引物特异性很强，其扩增不出在冬瓜熟腌过程中出现的其它优势菌，如醋酸钙不动杆菌（不动杆菌属），食窦魏斯氏菌（魏斯氏菌属），弯曲乳杆菌（乳杆菌属），盐脱氮芽孢杆菌（芽孢杆菌属），产气肠杆菌（肠杆菌属）和金黄色葡萄球菌（葡萄球菌属）。因此，该引物可用于定量检测冬瓜熟腌过程中类肠膜明串珠菌的数量变化。
[0077] 该类肠膜明串珠菌的扩增引物用于冬瓜熟淹过程中定量检测优势菌的过程如下：
[0078] 1、实验原料
[0079] 熟腌冬瓜，同实施例1
[0080] 2、实验材料及试剂
[0081] dNTP、Ex-Taq、Buffer、Mg2+、6×Loading Buffer：购自大连宝生物工程有限公司。
[0082] DNA Marker：购于大连宝生物工程有限公司
[0083] DNA回收试剂盒： 购于上海生工
[0084] LB培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，滴加5N NaOH(约0.2mL)，调节pH值至7.0。高温高压灭菌后，4℃保存。
[0085] 选择性LB培养基（Amp+）：在1L LB液体培养基中加入1mL氨苄（Ampicillin）(100mg/mL)后均匀混合，4℃保存。
[0086] 50×TAE：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5M EDTA(pH8.0)，去离子水定容至1L。
[0087] SYBR Green试剂盒：购于大连宝生物工程有限公司（货号：DRR420A）
[0088] 特异性引物，如上所述。
[0089] 3、试验方法
[0090] 1）DNA模板的制备
[0091] 用实施例1所述克隆文库中测序结果为含有类肠膜明串珠菌16S rDNA的大肠杆菌作为模板，并对其进行PCR扩增：扩增体系：H2O 39 ul，Buf 5 ul，dNTP 4 ul，M13F 1ul，M13R 1ul，Ex-Taq 0.25ul，模板1ul
[0092] 扩增程序：95℃预变性3min，30个循环(94℃变性50s，56℃退火50s,72℃延伸1min30s)，72℃最终延伸10min，最后保持在4℃。
[0093] 2）PCR产物的回收
[0094] 将PCR扩增完毕，于1%的琼脂糖凝胶上电泳，然后采用琼脂糖胶回收试剂盒切胶纯化。具体步骤与实施例1步骤4相同。
[0095] 3）回收产物浓度测定
[0096] 对上一步切胶回收纯化的样品用超微量紫外分光光度计进行DNA浓度的测定：根-1 23 9据 copis(ul )=amount×6.02×10 /length×10×650计算可得每个标准品的拷贝数。参数说明：amount是样品测得的浓度（ng/ul），length是DNA片段长度。
[0097] 4）模板梯度稀释
[0098] 对已知浓度的DNA样品进行梯度稀释（取10ul样品加90ul无菌水充分混匀，然后短暂离心）并进行荧光定量PCR
[0099] 5）荧光定量PCR条件摸索
[0100] 调节PCR扩增的条件，是的扩增效率在0.95到1.05之间，R2在0.95之上。最终得到的PCR条件分别为：类肠膜明串珠菌（Weissella paramesenteroides）：PCR反应体系：20ul（SYBR Green：10 ul，类肠膜明串珠菌上下游引物wp71f /wp201r（溶剂是灭菌双蒸水，引物浓度均为10umol）：各0.5 ul，模板1 ul，H2O：8 ul）；PCR反应条件为：预变性95℃保持2分钟，40个循环（95℃15s，57℃ 20s，72℃ 20s），溶解曲线（95℃15s，60℃15s，升温
20min，95℃15s），最后4℃保持。
[0101] 6）荧光定量PCR
[0102] 取模板DNA和待测DNA样品（即实施1步骤2中提取的DNA），分别按步骤（5）中的PCR条件同时做3个重复的定量实验。
[0103] 7）类肠膜明串珠菌定量标准曲线的绘制
[0104] 以模板拷贝数的对数为横坐标x，以仪器获取的阈值为纵坐标y，绘制类肠膜明串2
珠菌的标准曲线。标准曲线为：y=-3.312x+38.17，R=0.9997。如图1所示，该曲线线性较好，灵敏度比较高。可用于熟腌冬瓜样品中类肠膜明串珠菌的定量分析。
[0105] 8）定量结果的计算
[0106] 冬瓜腌制过程中优势微生物的16S rDNA的拷贝数可以根据标准曲线计算出来，考虑到提取DNA时所用的卤水量和无菌超纯水的量，微生物数量可以按下面的公式来计算：
[0107] 微生物数量（cfu/ml）= 拷贝数×120×（50×3.6）-1
[0108] 其中：120：无菌超纯水的用量（ul）
[0109] 50：提取DNA时所用的卤水的量（ul）
[0110] 3.6：平均每个微生物细胞所含有的16S rDNA的拷贝数(Klappenbach JA, Saxman PR, Cole JR, Schmidt TM, 2001. The ribosomal RNA operon copy number database[J]. Nucleic Acids Res. 29, 181-184.) 。
[0111] 三、具体实施例3
[0112] 一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，优势菌为醋酸钙不动杆菌，醋酸钙不动杆菌的上游引物为5′- GGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATC -3′，下游引物为5′- AACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGC -3′。该引物的设计中注重与冬瓜熟腌过程中出现的优势菌群相区分，如：魏斯氏菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属或葡萄球菌属的细菌；由引物验证试验结果图6可见，醋酸钙不动杆菌的上下游引物特异性很强，其扩增不出在冬瓜熟腌过程中出现的其它优势菌：如类肠膜明串珠菌（魏斯氏菌属），食窦魏斯氏菌（魏斯氏菌属），弯曲乳杆菌（乳杆菌属），盐脱氮芽孢杆菌（芽孢杆菌属），产气肠杆菌（肠杆菌属）和金黄色葡萄球菌（葡萄球菌属）。因此，该引物可用于定量检测冬瓜熟腌过程中醋酸钙不动杆菌的数量变化。
[0113] 该醋酸钙不动杆菌的扩增引物用于冬瓜熟淹过程中定量检测优势菌的过程如下：
[0114] 同时实例2，其区别在于：用实施例1所述克隆文库中测序结果为含有醋酸钙不动杆菌16S rDNA的大肠杆菌来制备DNA模板，荧光定量PCR反应采用醋酸钙不动杆菌的特异性扩增引物，醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)荧光定量PCR反应体系：20ul（SYBR Green：10 ul，醋酸钙不动杆菌上下游引物溶液Aci41f /Aci475r：各0.5 ul，模板1 ul，H2O：8 ul）；PCR反应条件为：预变性95℃保持2分钟，40个循环（95℃15s，60℃
20s，72℃ 20s），溶解曲线（95℃15s，60℃15s，升温20min，95℃15s），最后4℃保持。
[0115] Acinetobacter calcoaceticus的标准曲线为y=-3.3083x+34.656，R2=0.9997，如图2所示，该曲线线性较好，灵敏度比较高，可用于熟腌冬瓜样品中醋酸钙不动杆菌的定量分析。
[0116] 四、具体实施例4
[0117] 一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，优势菌为食窦魏斯氏菌，食窦魏斯氏菌的上游引物为5′- GAGTAACTGTTCAGTGTGTGACGG -3′，下游引物为5′- TCATCCAGTTTCCAAAGCCAT -3′。该引物的设计中注重与冬瓜熟腌过程中出现的优势菌群相区分，如：不动杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属或葡萄球菌属的细菌；由引物验证试验结果图7可见，食窦魏斯氏菌的上下游引物特异性很强，其扩增不出在冬瓜熟腌过程中出现的优势菌：类肠膜明串珠菌（魏斯氏菌属），醋酸钙不动杆菌（不动杆菌属），弯曲乳杆菌（乳杆菌属），盐脱氮芽孢杆菌（芽孢杆菌属），产气肠杆菌（肠杆菌属）和金黄色葡萄球菌（葡萄球菌属）。因此，该引物可用于定量检测冬瓜熟腌过程中食窦魏斯氏菌的数量变化。
[0118] 该魏斯氏菌属的扩增引物用于冬瓜熟淹过程中定量检测优势菌的过程如下：
[0119] 同时实例2，其区别在于：用实施例1所述克隆文库中测序结果为含有食窦魏斯氏菌16S rDNA的大肠杆菌来制备DNA模板，荧光定量PCR反应采用食窦魏斯氏菌属的特异性扩增引物，食窦魏斯氏菌荧光定量PCR反应体系：20ul（SYBR Green：10 ul，食窦魏斯氏菌上下游引物溶液wei472f /wei662r：各0.5 ul，模板1 ul，H2O：8 ul）；PCR反应条件为：预变性95℃保持2分钟，40个循环（95℃15s，60℃ 20s，72℃ 20s），溶解曲线（95℃15s，
60℃15s，升温20min，95℃15s），最后4℃保持。
[0120] 食窦魏斯氏菌的标准曲线为y=-3.3183x+35.651，R2=0.9995，如图3所示，该曲线线性较好，灵敏度比较高，可用于熟腌冬瓜样品中魏斯氏菌属的定量分析。
[0121] 五、具体实施例5
[0122] 一种冬瓜熟腌过程中的优势菌群的扩增引物，优势菌为弯曲乳杆菌，弯曲乳杆菌的上游引物为5′- GAACGCACTCTCGTTAGATTG -3′，下游引物为5′-
CAAATGTTATCCCCCACTTTAG -3′。该引物的设计中注重与冬瓜熟腌过程中出现的优势菌群相区分，如：魏斯氏菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属或葡萄球菌属的细菌；由引物验证试验结果图8可见弯曲乳杆菌的上下游引物特异性很强，其扩增不出在冬瓜熟腌过程中出现的优势菌：类肠膜明串珠菌（魏斯氏菌属），醋酸钙不动杆菌（不动杆菌属），食窦魏斯氏菌（魏斯氏菌属），盐脱氮芽孢杆菌（芽孢杆菌属），产气肠杆菌（肠杆菌属）和金黄色葡萄球菌（葡萄球菌属）。因此，该引物可用于定量检测冬瓜熟腌过程中弯曲乳杆菌的数量变化。
[0123] 该弯曲乳杆菌的扩增引物用于冬瓜熟淹过程中定量检测优势菌的过程如下：
[0124] 同时实例2，其区别在于：用实施例1所述克隆文库中测序结果为含有弯曲乳杆菌16S rDNA的大肠杆菌来制备DNA模板，荧光定量PCR反应采用弯曲乳杆菌的特异性扩增引物，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)荧光定量PCR反应体系：20ul（SYBR Green：10 ul，弯曲乳杆菌上下游引物溶液lac37f /lac158r：各0.5 ul，模板DNA 1 ul，H2O：8 ul）；
PCR反应条件为：预变性95℃保持2分钟，40个循环（95℃15s，57℃ 20s，72℃ 15s），溶解曲线（95℃15s，60℃15s，升温20min，95℃15s），最后4℃保持。
[0125] Lactobacillus curvatus的标准曲线为y=-3.2632x+32.393，R2=0.9991，如图4所示，该曲线线性较好，灵敏度比较高，可用于熟腌冬瓜样品中弯曲乳杆菌的定量分析。
[0126] 六、实验结果与分析
[0127] 冬瓜熟腌过程中优势微生物的定量测定结果
[0128] 由图1-4的标准曲线以及定量计算方法可得在熟腌过程中，4种优势微生物在腌制过程中的数量变化，如表2所示：
[0129] 表2熟腌过程中优势微生物的数量
[0130]
[0131] 由表1可知，醋酸钙不动杆菌在腌制的过程中变化不大（除了第10天），其数量基7
本都保持在10 cfu/ml左右。食窦魏斯氏菌除了第10天的时候有下降，其他时期都是逐
8
渐增加的，到了腌制的后期，其数量保持在10 cfu/ml以上。但是食窦魏斯氏菌在腌制过程中一直都是腌制体系的优势微生物，这一点与16S rDNA克隆文库的结果存在差异。弯曲
6
乳杆菌在第十天时最多，达到5.41×10 cfu/ml，但在其他腌制阶段其数量都很少。类肠膜明串珠菌只在后期才在腌制体系中占优势，这与16S rDNA克隆文库的结果相同。
[0132] 第10天时，腌制体系中微生物的数量都相对比较少，主要是因为弯曲乳杆菌快速生长并产酸，低的pH条件使得多数微生物的生长受到抑制。当pH下降到一定的程度时，弯曲乳杆菌的生长也受到抑制，最后数量减少。之所以定量实验结果会与16S rDNA克隆文库存在差异，是因为在16S rDNA克隆文库中使用的是通用引物，而通用引物由存在一定的偏好性。
[0133] 综上所述，在冬瓜熟腌的初期，腌制体系中的优势菌为不动杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属；在冬瓜熟腌的早期，优势菌则转变为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；在冬瓜熟腌的中期，优势菌属变为乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属；在冬瓜熟腌的后期，优势菌为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。醋酸钙不动杆菌在腌制的过程中变化不7
大（除了第10天），其数量基本都保持在10 cfu/ml左右。魏斯式菌除了第10天的时候有
8
下降，其他时期都是逐渐增加的，到了腌制的后期，其数量保持在10 cfu/ml以上。但是魏斯式菌属在腌制过程中一直都是腌制体系的优势微生物。弯曲乳杆菌在第十天时最多，达
6
到5.41×10 cfu/ml，但在其他腌制阶段其数量都很少。类肠膜明串珠菌只在后期才在腌制体系中占优势。
[0134] 当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
