[0026] 图1为设计的GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)质粒结构图。
[0027] 图2为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)酶切鉴定图;泳道1为DNA Marker,泳道2为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/pET-28a,泳道3为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)双酶切。
[0028] 图3为重组表达GSHS-SLO-SHS的SDS-PAGE图谱;泳道1为蛋白Marker,泳道2为 GSHS-slo-SHS/pET-28a的胞内上清。
[0029] 以下通过实施例来进一步阐明本发明,下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。
[0030] TB培养基:甘油5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO412.54 g/L,KH2PO4 2.31 g/L。
[0031] LB培养基:在1L去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl,用1mol/L NaOH调节pH至7.4,121℃高压下蒸汽灭菌20min。
[0032] 实施例1双Tag(GSHS和SHS)融合的链球菌溶血素成熟蛋白全序(GSHS-SLO-SHS)基因GSHS-SLO-SHS基因设计与表达质粒设计
[0033] 在编码溶血素融合蛋白基因SLO核苷酸的5’端和3’端分别添加多肽GSHS (GSSSSHHHHHHHHSS)和SHS(SSHHHHHHSS),在基因上游添加NocⅠ位点序列,在基因下游加上BamHⅠ序列。
[0034] 化学合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,将合成的片段与PMD18T载体酶切后(酶切位点NocⅠ和BamHⅠ)连接得到连接产物;将连接产物转化至DH5α(具体转化步骤参见全式金DH5α说明书),转化产物涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板,经过37℃培养过夜(10h~14h)得到单克隆转化子,挑取单克隆至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液,将菌液进行菌落PCR鉴定,将鉴定通过的菌液提取质粒(步骤详见OMEGA质粒提取试剂盒),质粒酶切鉴定和测序验证,得到质粒 GSHS-slo-SHS/PMD18T。
[0035] 菌落PCR所用引物:
[0036] F1:5’ATGGGCTCTT CTTCTTCTCA CC3’,SEQ ID NO.5;
[0037] R1:5’TTAAGAAGAG TGGTGGTGGT GGTGGTGAG3’,SEQ ID NO.6。
[0038] 实施例2GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)表达载体构建
[0039] 实现融合基因在大肠杆菌中表达的载体是pET-28a(+),但对构架有较大改变,不使用 pET-28a(+)的二个His-tag和Thrombin序列(质粒结构如图1所示,载体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示),将pET-28a(+)质粒和GSHS-slo-SHS/PMD18T用NocⅠ和BamHⅠ进行酶切,将酶切产物切胶回收得到回收产物,将回收产物再用T4连接酶连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,经过37℃培养过夜(12h~14h)得到单克隆转化子,挑取单克隆至含100μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液,将菌液进行菌落PCR鉴定(所用引物同实施例1中的F1和R1),将鉴定通过的菌液提取质粒,质粒酶切鉴定(见图 2)和测序验证。鉴定得到的菌株命名为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/DH5α,质粒命名为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)。
[0040] 实施例3GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达工程菌构建
[0041] 将GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)转化大肠杆菌宿主BL21(DE3),再在100μg/mL卡那霉素的 LB平板,经过37℃培养过夜(12h~14h)得到单克隆转化子,挑取单克隆至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液,将菌液进行菌落PCR鉴定 (所用引物同实施例1中的F1和R1)并进行测序验证,将验证得到单克隆转化子命名为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)。
[0042] 转化步骤:使用热激转化法:
[0043] (1)将10μL连接产物导入100μl BL21感受态细胞;
[0044] (2)冰浴15-30min;
[0045] (3)42℃水浴热激90s,取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min;
[0046] (4)加入800μL无抗性LB培养基混匀,于37℃,200rpm培养1h;
[0047] (5)5000rpm离心2min收菌;
[0048] (6)移去上清,剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含100μg/mL卡那霉素抗性平板上,37℃恒温培养12h左右,得到单克隆菌落。
[0049] 实施例4溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS表达
[0050] 摇瓶发酵:将GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)构建的工程菌分别接种在含100μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜(12h~14h),后接入TB发酵液体培养基,37℃培养到细菌OD600到0.8,最佳表达条件为用0.5mM IPTG诱导,降温至25℃培养,表达
48h,得到发酵液。
[0051] 蛋白的纯化:将发酵液于4℃、6000rpm离心10min,取菌体。加入10mL结合液A(20mM 磷酸钠、0.5mM NaCl、20mM咪唑、1%甘油,用HCl调pH至7.4)充分重悬菌体,然后将离心管置于冰浴中,放入超声波细胞破碎仪中,超声破碎的条件为:工作时间4s,间隔时间 4s,共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心,4℃、8000rpm离心30min,得粗蛋白液。用0.45μm微孔滤膜过滤,备用。
[0052] 准备镍离子亲和层析柱,首先,在4℃环境下利用恒流泵,向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6~12倍柱体积),然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液(500mmol/L NaCl,50mM PBS调节pH至6.0)pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液),将得到的过膜粗蛋白液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡,再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液,获得达到电泳纯的目的蛋白。
[0053] 蛋白产量的测定:参照Bradford的方法[Bradford MA.Rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein 2dyebinding.Anal Biochem,1970,72:248–254]采用考马斯亮蓝G 2 250法进行可溶性蛋白含量测定。
[0054] 以HisTRAP H.P(GE company)柱,用10倍柱体积Loading Bufffer平衡柱子,上述过滤上清液直接上柱,上样后用Loading Bufffer洗柱至OD280吸收值至基线,用Elution Buffer (20mM PBS,0.5M NaCl,300mM咪唑,Ph7.4)洗脱,收集洗脱峰,进行SDS-PAGE分析纯度,结果显示纯度达到95%。
[0055] 摇瓶发酵表达结果表明,在25℃条件下表达48h后,GSHS-slo-SHS工程菌OD600可以达到2.5。
[0056] 本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有较高的蛋白产量,蛋白产量达到4mg/mL,胞内占比可达40%。
[0057] 实施例5溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的融血活性测定
[0058] 溶血素融合蛋白样品可用溶液A(溶液A:36mM H3PO4,126mM NaCl,1g/L BSA(牛血清白蛋白),pH 7.0)进行系列梯度稀释。将0.5mL的150mM 2-mercaptoethanol与1mL稀释样8
品混匀,30℃孵育15min,然后每管加0.5mL含绵羊红细胞的A溶液(1.58×10cell/mL)30℃下反应20min,离心后,用541nm检测上清中血红蛋白的浓度。
[0059] 1U定义为在该实验条件下,引起上述反应体系中红细胞溶解的最小蛋白量。
[0060] 经测定,融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有溶血性,表达蛋白溶血活性产率为5×107HU/6
mL 培养基,前人最佳表达体系的溶血活性产率为2.4×10HU/mL培养基。
[0061] 实施例6溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的稳定性测定
[0062] 溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的胞内表达上清样品,可直接在-80℃保存二年,融血活性保持80%。本溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS样品在冻干保存状态下,活性持久稳定与独立表达的SLO全单蛋白一致。
[0063] 实施例7溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS抗原性鉴定
[0064] 采用免疫双向扩散法,将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。将1%agar融化后,置56℃水浴。在玻璃板上铺胶,约1.5mm厚,凝固后打孔(直径3mm),孔间距10mm。将溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS与SLO抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内,使两者进行相互扩散,在保湿的盒内,37℃,扩散24h。采用同一抗 SLO血清,阳性对照采用天然链球菌溶血素蛋白,阴性对照使用大肠杆菌胞内上清蛋白,检测的抗原样品为用大肠杆菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS。结果显示,天然链球菌溶血素蛋白和GSHS-SLO-SHS的抗原抗体反应结果为阳性,大肠杆菌胞内上清蛋白的抗原抗体反应结果为阴性。
[0065] 对比例1
[0066] (1)独立表达SLO工程菌的构建
[0067] 具体实施方式同实施例1~3,区别在于,将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列替换为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列,构建得到单克隆转化子命名为sslo/pET-28(a+)/BL21(DE3)。
[0068] 菌落PCR所用引物:
[0069] F1:5’ATGGGCAACA AAAAAACTTT 3’,SEQ ID NO.7;
[0070] R1:5’TTTGTAGGTG ATTGAGCCAT ACGG 3’,SEQ ID NO.8。
[0071] (2)独立表达SLO工程菌表达的SLO蛋白性质测定
[0072] 具体实施方式参见实施例4,摇瓶发酵表达结果表明,在25℃条件下表达48h后,SLO 独立表达的工程菌OD600为1.60;蛋白表达产量最高为0.3mg/mL,胞内占比达0.3%。
[0073] 具体实施方式参见实施例5,测定溶血活性,表达酶活为1×106HU/mL培养基。
[0074] 具体实施方式参见实施例6,测定独立表达SLO蛋白菌株表达的蛋白的稳定性,SLO全蛋白独立表达的上清直接在-80℃保存二年,融血活性剩余40%。
[0075] 具体实施方式参见实施例7,测定独立表达SLO蛋白的抗原性,结果为阳性。
[0076] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。