发明内容
[0006] 本发明的目的是,针对上述现有技术的不足,提供一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法,该新的花青素制备方法显著提高了花青素的制备效率,降低了花青素的生产成本。
[0007] 为达上述目的,本发明所采用的技术方案是:一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法,结合参见图1,该方法包括如下步骤:
[0008] A、选生长旺盛的茶树,取新梢上第3片展开叶,灭菌后切成小块;
[0009] B、将切得的小块叶片转入愈伤组织培养基中培养,每2周更换一次愈伤组织培养基(即每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基中进行继代培养);其中,愈伤组织培养基的组成为:2.2g/L MS盐+0.05-0.2mg/L TDZ(噻苯隆)+0.05-0.10mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.10-0.20mg/L GA3(赤霉素)+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉,培养条件为:21℃,10小时光照、
14小时黑暗,光照强度1200lux,相对湿度70-85%;
[0010] C、待培养出现红色愈伤组织并长到体积为0.8-1.2立方厘米时,将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块,按愈伤组织:悬浮培养基为1:100的体积比,将愈伤组织转入悬浮培养基中振动培养4周;其中,悬浮培养基的组成为:4.4g/L MS盐+0.05-0.2mg/L TDZ+0.05-0.10mg/L IBA+0.10-0.20mg/L GA3(赤霉素)+25.0g/L蔗糖,培养条件为:29℃,16小时光照、8小时黑暗,光照强度3000lux,相对湿度为70-85%,振动速度100-110rpm;
[0011] D、悬浮培养后,转入诱导培养基中震荡培养1周;其中,诱导培养基的组成为:1.1g/L MS盐+0.12mg/L噻苯隆+0.08mg/L吲哚丁酸+15.0g/L蔗糖+0.8-1.2g/L二氢杨梅素;
培养条件为:20℃,12小时光照、12小时黑暗,光照强度4000lux,相对湿度70-85%,振动速度90-100rpm;
[0012] E、诱导培养后收集悬浮培养细胞,干燥后粉碎至100mu,然后于悬浮培养细胞中加入0.7-1.5%体积浓度的盐酸乙醇溶液于55-65℃超声提取2-3次,每次提取条件为:超声功率200-300w,时间30-50min,每1g悬浮培养细胞加20-50ml盐酸乙醇溶液;合并提取液,真空浓缩直至溶剂全部挥干,得到花青素产品。
[0013] 上述提及的茶树品种为尖波黄、碧香早或福鼎大白。
[0014] 上述步骤A中的灭菌是指将茶叶以1%体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18-20min,取出,用灭菌水冲洗干净后用无菌风吹干,无菌条件下将叶片切成小块(小块面积以0.8-1.2平方厘米为宜)。
[0015] 上述提及的MS盐为市购产品。
[0016] 本发明的优点是:①首次建立了富含花青素的茶叶愈伤组织诱导方法;②首次建立了富含花青素的茶叶悬浮组织培养方法;③首次建立了茶叶悬浮培养细胞中花青素的提取方法;④获得了花青素含量>6%以上的生物组织,远远高于目前报道的任何材料。