[0034] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例提供一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP：
[0037] 对苋菜抑菌蛋白Uniprot ID：Q96322（基因名AAP，Gene ID: AAB67746.1）氨基酸序列进行跨膜区分析，信号肽分析和疏水性分析，得到该基因编码284个氨基酸，6‑26aa为跨膜区，1‑31aa为信号肽序列，局部亲水性好，预计表达蛋白可溶，选取32‑284aa进行毕赤酵母表达。32‑284位氨基酸序列即为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，命名为苋菜抑菌蛋白AmaAAP。
[0038] 实施例2
[0039] 本实施例提供一种编码上述的苋菜抑菌蛋白AmaAAP的基因：
[0040] 对SEQ ID NO:1所示氨基酸序列按毕赤酵母菌密码子偏好性进行密码子优化，优化后的核苷酸序列为SEQ ID No:2，命名为苋菜抑菌蛋白AmaAAP基因。
[0041] 实施例3
[0042] 本实施例提供一种含有苋菜蛋白AmaAAP基因的表达载体，所述表达载体是通过以下步骤构建的：
[0043] 在实施例2得到的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的苋菜抑菌蛋白AmaAAP基因的两端添加酶切位点EcoRI/NotI以及His标签后，对其进行全基因合成，得到基因片段；本实施例的全基因合成是委托生工生物工程（上海）股份有限公司（以下简称为生工）完成的；
[0044] 用EcoRI/NotI双酶切载体pPIC9K和上述步骤所得的基因片段，回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pPIC9K连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌XL10感受态中，挑取其阳性克隆以pPIC9K载体通用引物进行PCR扩增（PCR参数设定为94℃预变性5min；94℃30s，52℃45s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃最后延伸10min），提取重组质粒，测序，得含有AmaAAP基因的重组质粒，即为构建的重组表达载体。
[0045] 其中，上述pPIC9K载体通用引物为：
[0046] 5’AOX: 5’‑GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC‑3’；
[0047] 3’AOX: 5’‑GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC‑3’。
[0048] 实施例4
[0049] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP，所述重组抑菌蛋白rAmaAAP为由所述SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的蛋白。
[0050] 实施例5
[0051] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP，所述重组抑菌蛋白rAmaAAP为与所述SEQ ID No:1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白。
[0052] 实施例6
[0053] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP，所述重组抑菌蛋白rAmaAAP为所述SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。
[0054] 实施例7
[0055] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP的制备方法：
[0056] 将实施例3所述的重组表达载体经SalI线性化，线性化质粒如图1所示，电转化至毕赤酵母GS115感受态中，挑选含有重组质粒的酵母菌株，以pPIC9K载体通用引物进行PCR（PCR参数设定为94℃预变性5min；94℃30s，52℃45s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃最后延伸10min），挑选经抗生素筛选后的含有重组质粒的酵母菌单菌落，将其放入YPD液体培养基中，并于30℃，220rpm摇培12h；吸取菌液于BMGY培养基中，于30℃，220rpm培养到OD600=0.5，离心，换成培养基BMMY(pH6.0)，每12h加入0.5%甲醇进行诱导，诱导条件为29℃，
220rpm，72h，制备得到上清表达的重组蛋白。
[0057] 收集诱导后的上清，并经生工TCA沉淀试剂盒(BSP012)沉淀目的蛋白，经SDS‑PAGE检测为约35kD的单一条带。
[0058] 目的蛋白经Sangon Biotech（D110002）Western Blot检测为35kD左右的单一条带，结果如图2所述。
[0059] 目的蛋白经镍柱亲和层析进行纯化，经SDS‑PAGE检测为约35kD的单一条带，结果如图3所示。
[0060] 其中，上述pPIC9K载体通用引物为：
[0061] 5’AOX: 5’‑GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC‑3’；
[0062] 3’AOX: 5’‑GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC‑3’。
[0063] 实施例8
[0064] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP的制备方法：
[0065] 本实施例与实施例7的区别在于：
[0066] 本实施例是将实施例5所述的重组抑菌蛋白rAmaAAP按照实施例3的步骤进行处理，得到含有AmaAAP基因的重组质粒。
[0067] 菌液在BMMY培养基中的诱导条件为：25℃，96h。
[0068] 实施例9
[0069] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP的制备方法：
[0070] 本实施例与实施例7的区别在于:
[0071] 本实施例是将实施例6所述的重组抑菌蛋白rAmaAAP按照实施例3的步骤进行处理，得到含有AmaAAP基因的重组质粒。
[0072] 菌液在BMMY培养基中的诱导条件为：30℃，48h。
[0073] 实施例10
[0074] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控辣椒疫霉病药物中的应用。
[0075] 本实施例采用的蛋白为实施例7制备的纯化后的重组蛋白。
[0076] 首先，配制添加蛋白和未添加蛋白的PD（PD配方：200g potato;20g dextrose; 加水至1L）溶液，其中未添加蛋白的为对照。然后通过将辣椒疫霉接种于上述溶液，观察辣椒疫霉的生长情况，计算菌丝生长抑制率。
[0077] 具体步骤为：
[0078] ①将4mL液体培养基PD与蛋白在培养皿中混合均匀，配制成不同浓度（0，0.01，‑10.02，0.04 μg·mL ）的蛋白平板。
[0079] ②在培养皿中心位置放入生长同步化的辣椒疫霉菌块（直径6 mm，20℃生长3d的辣椒疫霉），空白对照为超纯无菌水。将培养皿置于20℃温箱培养。
[0080] ③培养6d后，测量对照组菌落直径（Dc）和蛋白组的菌落直径（Dn），抑制率I=[(Dc‑Dn)]/[Dc‑6]。每个浓度下3次重复，菌落直径取平均值。
[0081] 抑菌活性测定的结果如图4所示，辣椒疫霉生长6d后，蛋白处理的辣椒疫霉直径要显著小于对照。以上数据表明，重组蛋白是一种对辣椒疫霉具有显著抑菌作用的蛋白。
[0082] 实施例11
[0083] 本实施例提供一种重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控水稻纹枯病药物中的应用。
[0084] 本实施例采用的AmaAAP蛋白为纯化后的rAmaAAP蛋白。
[0085] 首先，配制添加蛋白和未添加蛋白的PD（PD配方：200g potato;20g dextrose; 加水至1L）溶液，其中未添加蛋白的为对照。
[0086] 然后，通过将纹枯病菌接种于上述溶液，观察纹枯病菌的生长情况，计算菌丝生长抑制率。具体步骤为：
[0087] ①将4mL液体培养基PD与蛋白在培养皿中混合均匀，配制成不同浓度（0，0.01，‑10.02，0.04 μg·mL ）的蛋白平板。
[0088] ②在培养皿中心位置放入生长同步化的纹枯病菌菌块（直径6 mm，28℃生长2d的辣椒疫霉），空白对照为超纯无菌水。将培养皿置于28℃温箱培养。
[0089] ③培养2d后，测量对照组菌落直径（Dc）和蛋白组的菌落直径（Dn），抑制率I=[(Dc‑Dn)]/[Dc‑6]。每个浓度下3次重复，菌落直径取平均值。
[0090] 抑菌活性测定的结果如图5所示，纹枯病菌生长2d后，蛋白处理的纹枯病菌直径要显著小于对照。以上数据表明，重组蛋白是一种对水稻纹枯病菌具有显著抑菌作用的蛋白。
[0091] 综上，本发明提供一种制备苋菜抑菌蛋白AmaAAP的方法以及利用该方法制备的蛋白对辣椒疫霉和水稻纹枯病菌的抑菌活性，填补了植物源抗菌肽在防治这两种病害中的空白。本发明不仅检索了苋菜核糖体失活蛋白AmaAAP基因，还为了提高外源基因表达水平优化了密码子，合成了适合毕赤酵母表达的核苷酸序列；而且为了保证外源基因的可溶性表达，切除了AmaAAP蛋白的信号肽区域，得到了适合外源表达的缺失型苋菜核糖体失活蛋白的氨基酸序列；建立了AmaAAP蛋白的毕赤酵母表达体系，能快速稳定的获得rAmaAAP蛋白。本发明提供的rAmaAAP对辣椒疫霉和水稻纹枯病菌具有明显的抑菌效果。本发明提供的缺失型苋菜核糖体失活蛋白AmaAAP是一种能够大规模生产的植物源抑菌剂，能减少化学杀菌剂的危害，对病害的生物防治和作物安全具有积极意义。
[0092] 本发明在全基因合成过程中加入了HIS标签蛋白，具有分子量小，带点少，免疫原性差的特点，并能特异性的结合镍离子，为后续的WB验证和蛋白纯化提供条件。利用毕赤酵母生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计生物农药的剂型提供更多选择。本发明构建了真核表达载体pPIC9K‑AmaAAP，转化毕赤酵母GS115后成功诱导表达了分子量约为35KD的蛋白，该蛋白主要在胞外表达。经镍琼脂糖亲和层析法纯化的蛋白经SDS‑PAGE鉴定，纯化的重组蛋白rAmaAAP纯度高。
