[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼肝脏抗菌肽，该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G-） 和革兰氏阳性菌（G+）均有抑菌作用。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
[0006] 本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val- Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW），MALDI-TOF-MS检测分子量为2686.66 Da。
[0007] 本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008] 1）金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比1 g：3～5mL加入沸腾的乙酸溶液（1%）中5～8 min，然后用高速组织捣碎机匀浆。
[0009] 2）金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至20～30℃，在功率为200～300W, 频率为50～80kHz 超声波发生器内超声提取30～45 min，9 000 r/min离心15～25 min，取上清液，冷冻干燥，得金枪鱼肝脏粗蛋白。
[0010] 3）金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比1 g：3～5mL加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5～7.5），按照肝脏粗蛋白质量的1.5～2.5%加入蛋白酶，于温度55～65℃下酶解2～4 h，得酶解产物。
[0011] 4）金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和层析，得到金枪鱼肝脏抗菌肽。
[0012] 作为优选，所述步骤3）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥2.0×104 U/g。
[0013] 再改进，所述步骤4）的超滤和层析的具体过程为：
[0014] 超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液；
[0015] 大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为10～20 mg/mL溶液，以3～5 mL/min加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽。
[0016] 凝胶层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率最高组分为凝胶层析酶解物。
[0017] 高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率得1个高活性抗菌肽TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW。
[0018] 优选，所述大孔树脂为AB-8。再优选，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述RP-HPLC条件为：进样量20～25 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8～1.0 mL/min；紫外检测波长215 nm。
[0019] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0020] （1）以金枪鱼肝脏为原料，提高了金枪鱼资源的利用率，减少了环境污染。
[0021] （2）制备的抗菌肽（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW）对革兰氏阴性菌（G-）（大肠杆菌（Escherichia coli）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa））和革兰氏阳性菌（G+）（金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea））均有抑菌作用。
[0022] （3）以食物源蛋白酶解所得的抗菌肽具有安全性高、来源丰富的优点，应用前景广阔。
