[0028] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0029] 以家蚕杆状病毒表达载体BmBacJS13、家蚕卵巢细胞BmN，参照bac‑to‑bac系统操作(Invitrogen公司)说明，来阐述本发明的实施内容。
[0030] BmBacJS13(图1)是一株与家蚕杆状病毒BmNPV具有相同感染特性的穿梭载体Bacmid[Construction of the Bac‑to‑Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218‑225]，储存于大肠杆菌DH10B中，用于以下本实施例方法中。
[0031] pFBD‑egfp‑gp1,2是在pFASTBacDUAL供体质粒中分别克隆了egfp基因和埃博拉膜蛋白GP基因[Efficient Expression and Processing of Ebola Virus Glycoprotein Induces Morphological Changes in BmN Cells but Cannot Rescue Deficiency of Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus GP64，Viruses，2019.11(11):1067]，本发明将对其进一步改造，用于本专利的实施。
[0032] 实施步骤：
[0033] 一、构建表达全长埃博拉GP蛋白的重组家蚕杆状病毒(对照病毒，BmBac‑egfp‑gp，附图1)
[0034] 取0.4μg供体质粒pFBD‑egfp‑gp1,2转化携带BmBacJS13和辅助质粒的DH10B感受态细胞中，转接大肠杆菌液体培养基中37℃培养4h。然后在含有Kanamycin，Gentamicin和IPTG、X‑gal的固体培养基平板上筛选重组Bacmid，挑取白斑菌落入大肠杆菌液体培养基，过夜培养后，提取DNA，PCR进一步鉴定，筛选正确的重组Bacmid，命名为BmBac‑egfp‑gp。
[0035] 在35mm细胞培养皿中各接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，用2μL lipofectin转染试剂、30μL无血清培养基和2μg BmBac‑egfp‑gp DNA混合液转染细胞，转染4h后，除去转染混合液，添加新鲜培养基常规培养，72小时后，收集上清。
[0036] 取50μL收集上清，继续感染健康BmN细胞，72小时收集上清，命名为vBmBac‑egfp‑gp。
[0037] 二、构建携带截短埃博拉膜蛋白GP基因序列并在其C端融合外源序列的重组病毒(本发明实施病毒，BmBac‑egfp‑gpshort，图1)
[0038] 第一步：扩增截短埃博拉囊膜蛋白GP基因
[0039] 用引物5’‑CGCTCTAGAATGGGCGTTACAGGAATATTG‑’3(Xba I)及5’‑CCCGGATCCGTCTCCATCCTGTCCACCAAT‑’3(Bam HI)，以含有埃博拉囊膜蛋白GP基因的质粒pFBD‑egfp‑gp1,2为模板，PCR方法扩增目的基因，扩增片段用Xba I和Bam HI酶切，回收，备用。
[0040] 第二步：合成外源序列
[0041] 合成：
[0042] 5’CGCGGATCCATGTTTGGTCATGTAGCTACCTTTGTAATTGTATTTATTGTAATTTTATTTTTGTACTGTATGGTTAGAAACCGTAATAGTAGACAATATTAAAAGCTTCCC3’，用BamHI和Hind III酶切，回收，备用。
[0043] 第三步：供体质粒的酶切
[0044] 分别用Xba I与Hind III酶切质粒pFast‑egfp‑gp1,2，回收载体，备用。
[0045] 第四步：构建截短埃博拉GP蛋白基因及融合外源序列的重组供体质粒
[0046] 将上述第一步、第二步及第三步回收的两个片段及供体质粒按照常规分子生物学方法连接，转化DH10B感受态细胞，筛选重组供体质粒，鉴定后，命名pFBD‑egfp‑gpshort，提取其DNA，溶解于20μL超纯水备用。
[0047] 第五步：构建携带截短埃博拉GP蛋白基因及外源序列的重组家蚕杆状病毒[0048] 取0.4μg上述构建载体pFBD‑egfp‑gpshort转化携带BmBacJS13和辅助质粒的DH10B感受态细胞中，转接大肠杆菌液体培养基中37℃培养4h。然后在含有Kanamycin，Gentamicin和IPTG、X‑gal的固体培养基平板上筛选重组Bacmid，挑取白斑菌落入大肠杆菌液体培养基，过夜培养后，提取DNA，PCR进一步鉴定，筛选正确的重组Bacmid，命名为BmBac‑egfp‑gpshort。
[0049] 在35mm细胞培养皿中各接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，用2μL lipofectin转染试剂、30μL无血清培养基和2μg BmBac‑egfp‑gpshort DNA混合液转染细胞，转染4h后，除去转染混合液，添加新鲜培养基常规培养，72小时后，收集上清。
[0050] 取50μL收集上清，继续感染健康BmN细胞，72小时收集上清，命名为vBmBac‑egfp‑gpshort。
[0051] 三、两种病毒表达埃博拉GP蛋白组装到BV病毒粒子上的效率比较(图2)
[0052] 在4mL细胞培养皿中各接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，分别用相同剂量的vBmBac‑egfp‑gp和vBmBac‑egfp‑gpshort感染细胞，感染后48小时，收集BV。加入120μL 1x上样buffer，95℃煮沸10分钟，12000rpm离心5min加样。
[0053] 配制10％聚丙烯酰胺凝胶，取5μL上述样品加入孔中。接通电源，进行电泳，直到指示剂跑到分离胶底部，然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶，切掉上部浓缩胶层，常规方法转NC膜后进行Western Blot检测。一抗用埃博拉膜蛋白GP多抗孵育，二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗兔多抗孵育，最后加入NBT和BCIP显色。以家蚕杆状病毒GP64蛋白作为内参。结果见图2左。两种病毒表达的GP64蛋白组装到BV上的效率没有变化，但是表达的埃博拉GP蛋白组装到BV上的效率有显著差异。Western Blot结果显示vBmBac‑egfp‑gpshort表达的蛋白组装到BV上检测条带明显加深，软件分析数据进一步表明组装效率高。结果见图2右。
[0054] 四、两种病毒表达埃博拉GP蛋白组装到BV病毒粒子囊膜上的效率比较(图3)[0055] 在4mL细胞培养皿中各接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，分别用相同剂量的vBmBac‑egfp‑gp和vBmBac‑egfp‑gpshort感染细胞，感染后48小时，收集BV。
[0056] 超速离心：在超离管中加入5mL 20％蔗糖溶液，取5mL BV溶液缓慢沿壁加于液体上层，离心(25000rpm，1.5h)。弃上清，沉淀加100μL TE buffer过夜溶解。
[0057] 解膜：取50μL上述超速离心的样品，加入等体积2％NP‑40静置0.5h；将裂解液转移到4mL 30％甘油，在各样品质量误差为0的情况下超离(35000rpm，1h，4℃)；上层(BV蛋白解膜液)用四倍预冷丙酮沉淀2h；离心(12000rpm，15min)加入5x10μL上样buffer悬浮加样。
[0058] 配制10％聚丙烯酰胺凝胶，取8μL上述样品加入孔中。接通电源，进行电泳，直到指示剂跑到分离胶底部，然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶，切掉上部浓缩胶层，常规方法转NC膜后进行Western Blot检测。一抗用埃博拉膜蛋白GP多抗孵育，二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗兔多抗孵育，最后加入NBT和BCIP显色。以家蚕杆状病毒GP64蛋白作为内参。结果见图3左。两种病毒表达的GP64蛋白组装到BV囊膜上的效率没有变化，但是表达的埃博拉GP蛋白组装到BV囊膜上的效率有显著差异。Western Blot结果显示vBmBac‑egfp‑gpshort表达的蛋白组装到BV上检测条带明显加深，软件分析数据进一步表明组装效率高。结果见图3右。
