[0025] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0026] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0027] 实施例1:
[0028] WSSV感染后我们提取对虾miRNA测序，结果表明miRNA表达上调，通过体外验证日本对虾体内miRNA表达量的变化
[0029] 将体重约为15g，体长约为10‑12cm，RT‑PCR检测WSSV为阴性的日本对虾置于70L水箱内有气泵充氧、盐度为26、温度为22℃的人工海水中暂养1‑2天后，使用1mL注射器，在对5 4
虾倒数第三节尾部注射100μL浓度为10 copies/mL的病毒稀释液(10个病毒粒子)。分别在注射后的0h、24h、36h及48h收集对虾血淋巴细胞，提取总RNA后进行cDNA反转录，所用的Stem‑loop Primer序列如下：
[0030]
[0031] 最后利用qPCR技术检测miRNA表达量，以U6作为内参。同时采用Northern blot检测miRNA表达量。
[0032]定量引物名称 定量引物序列
U6‑F 5’‑TTCACGAATTTGCGTGTCAT‑3’(SEQ ID No.4)
U6‑R 5’‑CGCTTCGGCAGCACATATAC‑3’(SEQ ID No.5)
miRNA‑F 5’‑CGCCGTATCACAGCCAGC‑3’(SEQ ID No.6)
miRNA‑R 5’‑TGCAGGGTCCGAGGTCACTG‑3’(SEQ ID No.7)
[0033] 结果见图1，数据显示日本对虾受到WSSV感染48h后其血淋巴细胞中miRNA的表达显著升高，表明miRNA可能参与了宿主病毒间的互作过程，因此，miRNA是潜在的WSSV防治的新靶点。
[0034] 实施例2:
[0035] 日本对虾体内miRNA的过表达试验
[0036] 按实施例1的方法随机将日本对虾分成3组，分别注射100μL/只的miRNA模拟物(体外合成，与日本对虾miRNA序列一致)或100μL/只的miRNA‑mimic‑scrambled(体外合成，与miRNA模拟物相同核苷酸组成但顺序随机打乱)或不处理。注射48h后参照实施例1的方法检测对虾血淋巴细胞中miRNA的表达量。
[0037]名称 miRNA‑mimic序列
miRNA‑mimic 5’‑TATCACAGCCAGCTTTGATG‑3’(SEQ ID No.8)
miRNA‑mimic‑scrambled 5’‑ATTCAGTGCGTCCAAACTAG‑3’(SEQ ID No.9)
[0038] 结果见图2，数据显示注射miRNA模拟物可以显著上调日本对虾体内miRNA的表达量，可用于后续功能试验。
[0039] 实施例3:
[0040] miRNA过表达促进WSSV在日本对虾体内增殖的试验
[0041] 按实施例1的方法随机将日本对虾分成3组，分别注射100μL/只的miRNA模拟物或100μL/只的miRNA‑scrambled或不处理。对照组注射WSSV与miRNA‑scrambled的混合液。分别提取注射0h、24h、36h及48h后日本对虾鳃组织的基因组DNA，然后通过qPCR技术进行病毒拷贝数的检测，所用引物和探针序列如下：
[0042] 引物或探针名称 引物或探针序列WSSV‑specific‑F 5’‑TTGGTTTCATGCCCGAGATT‑3’(SEQ ID No.10)
WSSV‑specific‑R 5’‑CCTTGGTCAGCCCCTTGA‑3’(SEQ ID No.11)
WSSV‑specific TaqMan probe 5’‑FAM‑TGCTGCCGTCTCCAA‑TAMRA‑3’(SEQ ID No.12)[0043] 结果见图3，数据显示日本对虾被WSSV感染后，注射miRNA模拟物能够促进病毒在宿主体内的复制。
[0044] 实施例4：miRNA过表达提高日本对虾累积死亡率的试验
[0045] 按实施例1的方法随机将日本对虾分成4组，实验组注射WSSV与miRNA的混合液，对照组注射WSSV与miRNA‑scrambled的混合液或仅注射WSSV或仅注射PBS。观察并记录WSSV感染一周的日本对虾累积死亡率。
[0046] 结果见图4，数据显示日本对虾被WSSV感染后，注射miRNA模拟物能够促进病毒在宿主体内的复制，从而使病毒感染导致的对虾累积死亡率显著升高。
[0047] 实施例5:
[0048] 按实施例1的方法随机将日本对虾分成3组，分别注射100μL/只的AMO‑miRNA或AMO‑miRNA‑scrambled或不处理。注射48h后参照实施例1的方法检测对虾血淋巴细胞中miRNA的表达量。序列如下：
[0049] AMO‑miRNA抑制日本对虾体内miRNA表达的试验
[0050] 名称 AMO‑miRNA序列AMO‑miRNA 5’‑CATCAAAGCTGGCTGTGATA‑3’(SEQ ID No.1)
AMO‑miRNA‑scrambled 5’‑GTAGTTTCGACCGACACTAT‑3’(SEQ ID No.13)
[0051] 结果见图5，数据显示注射AMO‑miRNA后日本对虾体内miRNA的表达量相较于对照组显著降低，即AMO‑miRNA可以显著抑制对虾体内miRNA的表达量，可用于后续功能试验。
[0052] 实施例6：AMO‑miRNA抑制对虾体内WSSV复制的试验
[0053] 按实施例3的方法，实验组注射WSSV(1×104)与AMO‑miRNA(50nM)的混合液，对照组注射WSSV与AMO‑miRNA‑scrambled的混合液，分别于注射0h、24h、36h和48h后按实施例3的方法检测病毒拷贝数。
[0054] 结果见图6，结果表明日本对虾被WSSV感染后，注射AMO‑miRNA能够显著抑制病毒在体内的复制，增加日本对虾的抗病毒能力。
[0055] 实施例7：AMO‑miRNA降低日本对虾累积死亡率的试验
[0056] 按实施例4的方法，实验组注射WSSV与AMO‑miRNA的混合液，对照组注射WSSV与AMO‑miRNA‑scrambled的混合液或仅注射WSSV或仅注射PBS。观察并记录WSSV感染一周的日本对虾累积死亡率。
[0057] 结果见图7，数据显示日本对虾被WSSV感染后，注射AMO‑miRNA能够抑制病毒在宿主体内的复制，从而使病毒感染导致的对虾累积死亡率显著降低。
[0058] 实施例8：High Five细胞内验证miRNA与Rab10 3’UTR相互作用的试验首先将Rab10基因的3’UTR克隆到pIZ/V5‑EGFP载体上，即野生型重组质粒。同时，将miRNA与Rab10基因结合的位点进行突变后构建到pIZ/V5‑EGFP载体上，即突变型重组质粒。将构建好的野生型重组质粒和突变型重组质粒分别与miRNA模拟物或模拟物对照共转染到High Five昆虫细胞内，48h后检测昆虫细胞的荧光强度。
[0059] 结果见图8，共转染野生型重组质粒和miRNA模拟物的细胞荧光强度与其他组相比要显著减弱，表明miRNA可与Rab10 mRNA 3’UTR互作。
[0060] 实施例9：对虾体内过表达miRNA降低Rab10的表达。
[0061] 在对虾体内通过注射miRNA模拟物(miRNA‑mimic)过表达miRNA，同时以注射miRNA模拟物对照(miRNA‑mimic‑scrambled)作为对照组。随后在其感染后的48h收集对虾的肌肉组织，检测Rab10的表达量。
[0062] 结果见图9，当miRNA过表达时，对虾体内Rab10的表达水平被显著抑制。
[0063] 实施例10：对虾体内抑制miRNA上调Rab10的表达。
[0064] 在对虾体内采用反义核酸(AMO‑miRNA)抑制miRNA表达，同样以注射AMO‑miRNA‑scrambled作为对照。随后在其感染48h后，取其肌肉组织检测，结果见图10，当miRNA的表达被抑制时，对虾体内Rab10的表达水平显著增加。这表明，miRNA与Rab10基因在对虾体内可发生互作。
[0065] 实施例11：对虾体内过表达miRNA促进自噬在对虾体内的发生。
[0066] 在对虾体内通过注射miRNA模拟物(miRNA‑mimic)过表达miRNA。随后在其感染后的0h、24h、36h和48h收集对虾的肌肉组织，检测p62和LC‑3Ⅱ/Ⅰ的表达量。在自噬发生过程中，LC3‑Ⅰ通过活化酶Atg7与结合酶Atg3与磷脂酰乙醇胺(PE)结合而成为LC3‑Ⅱ，LC‑3Ⅱ/Ⅰ的比例上升表明自噬发生。而p62则通过与短的LC3相互作用区域(LIR)直接与LC3和GABARAP(Atg8直向同源物)家族蛋白结合，以通过自噬降解的机制来用作递送选择性自噬货物。p62蛋白本身会被自噬降解，并作为研究自噬通量的标记。当自噬被抑制时，p62会积累，而自噬被诱导时，p62数量会减少。结果见图11，当miRNA过表达时，可促进自噬在对虾体内的发生。
[0067] 实施例12：对虾体内抑制miRNA的表达抑制自噬在对虾体内的发生。在对虾体内通过注射反义核酸(AMO‑miRNA)以抑制miRNA的表达。随后在其感染后的0h、24h、36h和48h收集对虾的肌肉组织，检测p62和LC‑3Ⅱ/Ⅰ的表达量。结果见图12，当AMO‑miRNA注射时，可以抑制自噬的发生，进而抑制WSSV的增值。
[0068] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
