[0053] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0054] 实施例1
[0055] 一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0056] 1）构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体：
[0057] 包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体；
[0058] a）博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物设计: 根据合成的博落回McDef1和McDef2基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，并根据表达载体pVT102U/α上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xba I 酶切位点，在Xba I 酶切位点前加有保护性碱基；下游引物设计在基因末端，并加上Hind Ⅲ 酶切位点，在Hind Ⅲ酶切位点前加有保护性碱基，所设置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分别为：
[0059] 博落回防御素McDef1基因上游引物：
[0060] 5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’Xba I 酶切位点，[0061] 博落回防御素McDef1基因下游引物：
[0062] 5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’ Hind III 酶切位点，
[0063] 博落回防御素McDef2基因上游引物：
[0064] 5’-CCGctcgag aaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’Xba I 酶切位点，
[0065] 博落回防御素McDef2基因下游引物：
[0066] 5’- GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’ Hind III 酶切位点。
[0067] b）PCR扩增：以cDNA文库中测序的相应单克隆质粒为模板，加入Taq DNA 聚合酶、博落回防御素McDef1和McDef2的上/下游引物、 dNTPs分别进行扩增反应。
[0068] PCR扩增的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μL， 4× dNTPs 2.0μL，浓度均为10pmol/μL 的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板为博落回cDNA1μL，ddH2O
17μL，浓度为1U的Taq DNA 聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 包含0.5mmol/L MgCl2、
50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris·HCl、4×dNTPs 包含用量均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP；其反应过程依次为：a、95℃处理1min ；b、依次94℃处理40s、60℃处理30s、72℃处理30s ；反应过程进行25 个循环；c、72℃延伸10min ；即获得博落回防御素McDef1和McDef2基因编码的功能蛋白的PCR 产物。
[0069] PCR扩增的结果如图1所示，从cDNA文库中克隆得到的McDef1和McDef2目的基因，大小约为140bp 150bp。~
[0070] c）获得目的片段：
[0071] 如图2所示的PCR扩增结果，阴性转化子中无目标基因片段，阳性转化子中含有目标基因片段McDef1和McDef2，说明本发明得到了含有目标片段McDef1和McDef2的阳性转化子。
[0072] d）构建重组表达载体：
[0073] 取合成的McDef1和McDef2，通过Xba I/ Hind III位点克隆到酿酒酵母表达载体pVT102U/α上,得到重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。DNA的重组操作依据《分子克隆实验手册》进行。
[0074] 2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌：
[0075] 取步骤3重组载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，具体步骤和条件：将表达载体质粒DNA，1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌悬液，20 μL；PEG 溶液（10×TE, 1 M LiAC,50% PEG 4000,以1:1:8 的体积比混合)1.5 mL 加入10 mL 无菌管中，混合， 30℃，200 rpm，培养30 min；42℃热击15 min 后，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200 μL 1×TE 洗涤，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200 μL 1×TE 溶液中；细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养
4-6天。
[0076] YSD营养缺陷筛选培养基，其配方如下： YNB（无氨基酵母氮源） 6.7 g/L，葡萄糖 20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 琼脂15 g/L，其余为水。
[0077] ）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白：
[0078] 取步骤2）中得到的工程菌（阳性转化子），挑取2 4个3 5mm的重组菌于3mLYSD液体~ ~培养基中，30℃，250rpm，培养12h；按1:25的比例将制备的种子液接种入50mLYSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；再按1:25的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养72h。
[0079] ）蛋白纯化：收集步骤3）发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化：
[0080] 收集步骤3）的发酵菌液，将发酵产物上清和预先用0.05M NH4AC (pH7.5)平衡过的DEAE 凝胶混合，室温放置0.5 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH 值调至4.2 后直接上预先用0.1M CH3COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的
0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰，0.3M NaCl洗脱时，有大的洗脱峰，进一步脱盐反相纯化，低温冻干。
[0081] 反相纯化后浓缩液用Tricine-SDS- PAGE 电泳图如图3所示，分别有一条大小约为5 6 kDa的蛋白条带，与目的蛋白大小相吻合，表明目的基因已经得到表达，即重组博落~回防御素功能蛋白McDef1和McDef2蛋白已经生产出来。
[0082] 实施例2
[0083] 一种重组博落回防御素功能蛋白的应用，包括以下几方面：
[0084] 本发明抑制细菌活性的测定均采用如下方法：
[0085] 1 .原理
[0086] 本法基于待测物质的杀菌抑菌能力，利用在特定条件下一定浓度的待测物质在含有微生物的培养基内扩散并形成固定大小的抑菌区域的原理进行测定。
[0087] 参考文献及标准
[0088] 《中华人民共和国兽药典》2010版——抗生素微生物鉴定法（QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素）
[0089] 3.试剂
[0090] 3.1 LB固体培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，琼脂1 .5g，pH7.0，121℃，灭菌 25 min。
[0091] 3.2 LB液体培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL， pH7.0，121℃，灭菌 25 min。
[0092] 3.3指示菌：购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠埃希氏菌CICC编号10389，金黄色葡萄球菌，猪沙门氏菌。
[0093] 分析步骤
[0094] 4.1指示菌的活化
[0095] 按照试剂3 .2的配方，配置50mL的培养液，挑取一个指示菌菌落于50mL液体培养基放入摇床，150 rpm，37℃，培养12 h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用无菌液体LB培养基调零，测定其OD值，如果OD值介于1 .5-2 .0，菌悬液的加入量为200微升每10mL LB固体培养基，如果OD值在2 .0-2 .5之间，菌悬液加入量为100微升每10mL固体培养基。
[0096] 4.2待测物质供试品
[0097] 准确称取待测物质100 mg，并溶于1.0mL的无菌水中，混匀，2000rpm，离心10min，留上清液作为高剂量浓度，并将其稀释10倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。
[0098] 4.3平板的制备
[0099] 加热融化试剂3 .1LB固体培养基，待其冷却置50℃时（刚好不烫手的温度），按步骤4 .1指定量加入大肠杆菌悬液和金黄色葡萄球菌悬液，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中，用无菌10mL移液管每次精确移取10mL试剂3.1已融化的LB固体培养基迅速轻放于水平操作台上至冷却，保证琼脂胶凝后培养基平面的平整度。
[0100] 4.4上样
[0101] 用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离打4个孔。分别加入80微升样品和阳性对照溶液。上样完成后，放入培养箱，37℃，大肠杆菌和猪沙门氏菌培养8 h，其中金黄色葡萄球菌培养24h；且每个样做3个平行样。
[0102] 4.5检测结果与分析
[0103] 检测结果为三个平行样的平均值。
[0104] 测试样品对大肠杆菌的抑菌效果如图4所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.3±0.1 cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为
2.6±0.1 cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为4.2±0.2 cm。McDef2发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌作用稍大于McDef1发酵产物对大肠杆菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的发酵产物对大肠杆菌的抑菌作用明显强于两者的单独抑菌作用，说明McDef1和McDef2博落回防御素对大肠杆菌的抑菌作用相互之间存在协同效应。
[0105] 测试样品对金黄色葡萄球菌的效果如图5所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.1±0.1cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.1±0.2 cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.7±0.2 cm。McDef2发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用大于McDef1发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显强于两者的单独抑菌作用，说明McDef1和McDef2博落回防御素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用相互之间存在协同效应。
[0106] 测试样品对猪沙门氏菌的抑菌效果如图6所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.4±0.3cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.1±0.2cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为5.8±0.4cm，根据抑菌圈的直径可知，McDef1和McDef2发酵产物对猪沙门氏菌的抑菌作用明显大于McDef1、McDef2发酵产物抑菌作用的和，McDef1和McDef2发酵产物混合后其抑菌作用存在协同效应，相互促进。
[0107] 实验结果说明，采用本发明含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌——酿酒酵母发酵得到的发酵产物，其分子量为5 6KD，发酵~产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的McDef1、McDef2，其抑菌活性高，尤其将两种防御素McDef1和McDef2结合使用，其抑菌效果更佳，安全，营养价值高。
[0108] 本发明通过对天然博落回防御素基因的改造，用基因工程的方法重组表达得到了具有高抑菌活性的博落回防御素功能蛋白，其可以用于制备抗菌药物；采用本发明工程菌表达得到的发酵产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性，适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存或者添加至制备抗菌药物中，工艺步骤简单，成本低廉，应用前景良好。
[0109] 以上通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以上的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
