[0059] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
[0060] 实施例1、GP73和AFP基因在不同细胞系内的本底转录情况
[0061] 相关引物：
[0062] GP73基因引物：
[0063] Sense：GGATGTCCTCCAGTTTCAGA；
[0064] Anti-sense：TTCCTCCACTTCCTTGTCAC
[0065] AFP基因引物：
[0066] Sense：CTTACACAAAGAAAGCCCC
[0067] Anti-sense：GTCCGATAATAATGTCAGCC
[0068] GAPDH基因引物：
[0069] Sense：ATTCCACGGCACAGTCAAGG
[0070] Anti-sense：ACATACTCAGCACCAGCATCG
[0071] 用TRIZOL方法提取处于对数生长期的肝正常细胞QSG-7701和肝癌细胞SMMC-7721、Huh7、Hep3B的总RNA，逆转录成cDNA，根据AFP基因和GP73基因的引物，以GAPDH为内参通过Q-PCR得到AFP和GP73两种基因的相对表达情况。
[0072] 具体如下：
[0073] 注：Q-PCR反应体系和反应条件为：
[0074]
[0075] 将上样好的八连管放入ABI7300荧光定量PCR仪，设置Q-PCR程序，循环条件为：
[0076]
[0077] 仪器在60s退火延伸时，收集数据。
[0078] 所得到的AFP和GP73两种基因的相对表达情况为：如图1所示GP73相对于AFP在肝正常细胞内表达量较低，在肝癌细胞Huh7和Hep3B中表达量要高于AFP；根据该相对表达情况，得出GP73的肝癌特异性要高于传统的肝癌标志蛋白AFP的结论。
[0079] 综上所述，将GP73启动子替换腺病毒的野生型启动子，比AFP启动子具有相对较高的安全性和较好的杀伤性。
[0080] 实施例2、新型GP73启动子在细胞内的活性评估
[0081] 报告基因质粒phRL-TK购自Promega公司，TK启动子控制下表达海肾荧光素酶；萤火虫荧光素酶报告基因分析用质粒pGL3-Basic(不含启动子及增强子)、pGL3-Control(含SV40启动子)购自Promega公司。
[0082] 1）相关质粒构建
[0083] 先设计如下引物：
[0084] p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG
[0085] p-2616:(Mlu I)CGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA
[0086] p-413:(Mlu I)CGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA
[0087] p-613:(Mlu I)CGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG
[0088] p-677:(Mlu I)CGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA
[0089] p-729:(Mlu I)TGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA
[0090] 备注说明：下划线代表酶切位点。
[0091] 利用上述GP73启动子两端特异性引物p-19:(Hind III)和p-2616:(MluI)，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，通过PCR方法扩增出GP73启动子，PCR体系为：
[0092]
[0093] PCR条件为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。所得序列具体如p-19/-2616片段的碱基序列所示（已发表）；用限制性内切酶MluI和Hind III双酶切PCR产物和pGL3-Basic载体，然后进行连接，构建得到含有p-19/-2616片段的质粒---pGL3-L2598质粒。
[0094] 以pGL3-L2598质粒为模板，用携带MluI和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR（PCR反应体系和反应条件同上）获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接得到pGL3-L711（即，p-19/-729）、pGL3-L659（即，p-19/-677）、pGL3-L595（即，p-19/-613）、pGL3-L395（即，p-19/-413）质粒。
[0095] 备注说明：所述p-19/-2616片段的碱基序列为：
[0096] p-19/-2616（2598bp）
[0097]tagtcccaccactctcgaaggctgaggcaggtggattgcttgagcccaggagtttgagaccagcctgggccacatgtcaaaacctcatctctacaaaaaataccaaaaaaattagctgagcatgatggcatacacctgtagtcccagttactcaggaggctgaggtgggagaatcacctgagcccaggaggttgaggctgtagtgagccatgatcacaccactgcacttctgccggggggacagagtgaaaccctgtctcaaaataaataaataaataaataaatattaaagcctttagggctgttgggatggaataaatgtattttgtatgtgagaaggatatgaactgggggtggtggggggcatagaagcagaatgctatggtttgaatgtgtgctccataaagcacgtgttgaaaactgaatctccagtgcaacagtgttgggaggtggggcccaaagggaggtgtttaggtcataaaggctccactcttataaataaattaatgccaattatagagggtttgaggctgcaagttcaatttcacatacaccctcttgcccttctgccttccaccacaggctgatgcagcaagaaggcccttgcaagatgccagcaccttgatattagacttcctagccttcagaactatgagaaatacatttcttttctttataaattactgagtctgtggaattgtgttatagcaacacaaaatggactaagacattaaggaaaggatgcttaacaggcaaaacatggatgcttccttcaaccaaccactgtagccccttgcacattgtttaatcaaaacccatccaattgaattttcagggccagcaactgattagcttttttataaggaatgtaaattatgtatatagatatatataaaactgcatcttaaaattttcaacttttgtcataaagaatctaacgaaaaggactaattcatcttcaattaaaatatagctcattcagccagctgccttagcacctagacatatggacctgttccataaagtgtttaagaatcactgagtgagtcgctaattagttgctgataaatgagagactaatggagaccctccttagaggcaaatgatatagaagttacagtccaccagtctaagaatgtaaactataccaagagagctaaaatgggcaagaaagggaatttcctgtacctgtccccgattatggttatttaagctcactagaagatcaaagtgacacaacttaagtctgcaaaaccagggctgacatctgatacagcctcagcttctgaatgctttggtctgaccctacaacagtttaacagttgcagataacaaaaatatcattttggaatatagtagaacattcctctaaaggggtcatgtatggtcagcttctaattcagctaagaggttttagctggtaaagatacgtttcctgcagttaagaagctccatgctcaggtagcaatagggtatcttgatcaccttttttaaggtgactctttgttctggttaaaatcaatttcagctgtgagcattcctttaggtgttcatgtatttacttgtttttttattgtgatttgagagaggcgcagaggaaggagtttcctttcccagacaccagagctaggaagacatgaagacatgattctaggaaaactgttctcaatcttggccgtatactgtattaggattatctgggaagctcaaaacaaacaaaaaatatcaagttcactttgaactctggaagtgggaccctggttcctaaatgctctaaaagctccccaaataattctaatggatggcaggtgctgccagagttaagaaccattgctttagaattttctagcatggtttccctgtaggtcactagttttgtggcattctctccgggaggtacggcctcatagggcttctcaaacatcagtgcgcctgagcgtcatctgaggcgctgtttcaaatgcagctgcccgggctataagatcacacccgaaggcgtccgggaatcttcactttttccgttgctagcagtggaagggtcacagaccaaacactaaggcctgagcggtgacaatcgaggcgagatgatggtcaacagggaatgcctcgtgggagaaaaaagacaattttgtgagtataagccccctaaaaacctgtttttcgttcgcttccttctctgggcagttttgacccgacgacttttataaagaaggtaacgtgagtgtggcgctgggtgcggttggctgttcgggaacattccctcggggcggaacgtgggatgggggctccccccaggtaccctttccccacagccgcttccccgctccgcgtcgctgctcaggcgccagctcccgcgtcggaaggggcgatggggtggcccgggggaaggggcaacgcccagcggcgagaactgggcgcacgctggcgttcctgctcccgccgaggggcggccaccggccggggcgcgcgcaccgtggggccgggagtccgcgcggccccggcagcccctgcctcgcttctccgcgctcgcggcgccgcctcctcccttcgcgccgccggcgctgctcgggggcggggccttgccgctgcggaggccgg
[0098] 2）GP73启动子在细胞内的活性评估
[0099] 将处于对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721、Huh7、Hep3B、Bel-7404和肝正常细胞QSG-7701按1×104个/孔接种于96孔培养板中（培养条件为：10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone公司），于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养），分别进行如下操作：
[0100] 待细胞贴壁后，用Thermo公司的R#0531转染试剂将p-19/-2616含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK1×10-3μg共转染细胞。培养48h后（培养条件为：10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone公司），于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养），去除培养基，用PBS洗两次，加入20μL PLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液（即，裂解后所得的液态物）转移到检测试管中，检测萤火虫荧光素酶活性，加入65μL的LARⅡ(Promega公司)反应（室温，2sec），用化学发光仪读取10sec发光光子数（RLU），然后检测海肾荧光素酶活性，加入Stop&Glo试剂(Promega公司)65μL反应（室温，
2sec），用化学发光仪读取10sec发光光子数（RLU）。计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU（按照试剂说明书操作），即得相对荧光素酶活性。
[0101] 如图1所示，在肝癌Huh7中GP73启动子具有较高的启动效率。
[0102] 同样将处于对数生长期的肝癌Huh7细胞按1×104个/孔接种于96孔培养板中，细胞贴壁后，用Thermo公司的R#0531转染试剂将上面构建得到p-19/-2616、p-19/-729、p-19/-677、p-19/-613、p-19/-413质粒含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK1×10-3μg共转染细胞。48h后，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μLPLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液转移到检测试管中，分别检测萤火虫荧光素酶RLU和海肾荧光素酶RLU，然后计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU即得相对荧光素酶活性。
[0103] 如图2所示，在所有质粒中p-19/-677质粒在肝癌Huh7细胞中具有较高的启动活性。
[0104] 实施例3、双靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建
[0105] 1）相关质粒的构建(下划线为所列酶切位点序列)
[0106] p-19:(SnaB I)TAGTACGTACCGGCCTCCGCAGCGGCAAG
[0107] p-677:(Xho I)CGCTCGAGTCATCTGAGGCGCTGTTTC
[0108] GM-CSF（sense）（：Hind III）CCAAGCTTATGTGGCTGCAGAGCCTGCT
[0109] GM-CSF（Anti-sense）（：BamH I）ATGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC
[0110] mGM-CSF（sense）（：Hind III）CCCAAGCTTATGTGGCTGCAGAATTTAC
[0111] mGM-CSF（Anti-sense）（：BamH I）CGGGATCCTCATTTTTGGCCTGGTT
[0112] EGFP（sense）（：BamHI）ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
[0113] EGFP（antisense）（：HindIII）CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC
[0114] 以健康人外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用GM-CSF上下游引物PCR得到GM-CSF基因，PCR反应体系为：
[0115]
[0116] PCR条件为94℃×45s，55℃×30s，72℃×30s。
[0117] 以小鼠外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用mGM-CSF上下游引物PCR得到mGM-CSF基因，PCR反应体系为：
[0118]
[0119] PCR条件为94℃×45s，56℃×30s，72℃×30s。
[0120] 以质粒pEGFP-C1为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR反应体系和所用引物具体如下；PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×1min。扩增的产物即为EGFP基因；
[0121] 所用引物：EGFP（sense）（：BamH I）ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，[0122] EGFP（antisense）（：Hind III）CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC；
[0123] 反应体系：
[0124]
[0125] 将以上基因用BamH I和Hind III双酶切，克隆到同样双酶切的pCA13上，得到pCA13-GM-CSF、pCA13-mGM-CSF、pCA13-EGFP质粒。
[0126] 备注说明：pCA13属于常规载体，购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40poly A加尾信号。
[0127] 用p-19(SnaBI)和p-677(XhoI)引物以构建好的p-19/-2616质粒为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR体系为：
[0128]
[0129] PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×45s。得到产物用SnaBI和XhoI双酶切，克隆到pXC2（常规载体，事先用SnaBI和XhoI双酶切）上，得到携带GP73核心启动子的pXC2-GP73质粒。
[0130] 备注：以p-19/-2616质粒为模板，上述扩增所得为p-19/-677。
[0131] 用Xho I和Xba I双酶切pXC2-GP73得到GP73-E1A片断，与同样用Xho I和Xba I双酶切的pSD55相连，得到pSD55-GP73。如需携带基因，要通过PCR获得目的基因，连接到用HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ酶切得到完整的基因表达框，连接到同样BglⅡ酶切的pSD55-GP73上，得到pSD55-GP73-gene质粒。
[0132] 备注说明：pSD55属于pShuttle质粒添加Ad5E1区（删除了E1B55区）构建而成的，pShuttle质粒为常规载体。
[0133] 将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体。
[0134] 备注说明：发表于2007年Nature Protocols上的《A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system》已经详细叙述了上述含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183。
[0135] 2）双靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建
[0136] 将重组构建好的GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒用Pac I线性化，去磷酸酸化后，转染到人胚肾细胞293A中包装病毒。以捷瑞公司Blood Kit抽提所得的病毒DNA（即上文中所告知的通过重组所构建的在293A细胞中扩增包装的病毒）作为模板，同时以野生型病毒DNA作为对照，以上述GP73核心启动子和目的基因引物、野毒上游引物：CGCGGGAAAACTGAATAAGA野毒下游引物：ACCGCCAACATTACAGAGTC进行PCR反应。
[0137] PCR反应体系为：
[0138]
[0139] PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min。对PCR产物进行检测，如PCR产物含GP73核心启动子和/或目的基因，不含E1B55野生型腺病毒DNA，病毒包装成功。重复此过程一次，得到重组正确的腺病毒（即，肝癌双靶向溶瘤腺病毒，目的溶瘤腺病毒GD55-gene）。
[0140] 备注说明：重复此过程一次的目的是：防止假阳性的现象，确保正确。
[0141] 肝癌双靶向溶瘤腺病毒在293A细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。具体操作方法见Microbix Biosystem Inc.的操作说明。
[0142] 实施例4、肝癌双靶向溶瘤腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测
[0143] 细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将肝癌细胞株Huh7及人正常肝细胞QSG-7701以5000个每孔的量铺入96孔板，贴壁后分别加入5MOI的病毒（肝癌双靶向溶瘤腺病毒），每隔24h测一次，连续四天，加入20μl的5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h后，去除孔内培养液，然后每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床缓慢振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定OD490值。细胞存活率=（病毒感染孔吸光值-调零孔吸光值）/（对照孔吸光值-调零孔吸光值）×100%。
[0144] 备注说明：上述细胞培养均为37℃，5%CO2恒温培养；培养基为10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone）。
[0145] 结果如图3和图4所示，肝癌双靶向溶瘤腺病毒对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤靶向性。
[0146] 备注说明：图3和图4中，“ZD55”、“GD55”、“GD55-GM-CSF”这3组都是腺病毒。ZD55是带有内源性E1A启动子且删除E1B55区的腺病毒；GD55是上述构建的用GP73启动子替换了ZD55内源性E1A启动子的腺病毒；GD55-GM-CSF是在GD55腺病毒的上面携带了GM-CSF基因的腺病毒。
[0147] 实施例5、溶瘤腺病毒GD55-EGFP和AD55-EGFP在肝癌Huh7中增殖能力的比较[0148] 备注说明：GD55-EGFP为在GD55腺病毒的上面携带了EGFP基因的腺病毒；
[0149] AD55-EGFP为在AD55腺病毒的上面携带了EGFP基因的腺病毒。
[0150] 将对数生长期的肝癌细胞Huh7按4×104每孔的量铺于24孔板中，贴壁后每孔分别加入1MOI、5MOI、10MOI、20MOI的GD55-EGFP或AD55-EGFP，培养48h后置于荧光显微镜下观察，结果如图5所示GP73核心启动子调控的溶瘤腺病毒的EGFP荧光量明显多于AFP启动子调控的溶瘤腺病毒的EGFP荧光量。
[0151] 备注说明：图5中AFP指的是感染AD55-EGFP病毒后表达EGFP绿色荧光的情况，GP73是指感染GD55-EGFP病毒后表达EGFP绿色荧光的情况。
[0152] 实施例6、双靶向溶瘤腺病毒在裸鼠体内治疗肿瘤移植瘤
[0153] 将4-5周龄的雌性裸鼠皮下接种肝癌细胞Huh7，每只裸鼠为3×106细胞，1-2周后当肿瘤达到100～250mm3进行动物分组。治疗组为两组分别给予2×109pfu/mice的GD55、GD55-mGM-CSF进行治疗，对照组分两组，第1组是磷酸缓冲液（PBS），第2组是2×109pfu/mice的ZD55进行尾静脉注射，试验结果如图6所示，肝癌双靶向性溶瘤腺病毒能够抑制肿瘤的生长，延长荷瘤裸鼠生命周期。
[0154] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
