[0016] 下面结合附图对本发明做进一步的分析。
[0017] 实施例1：点突变Bcl2
[0018] 小鼠Bcl2 cDNA和人Bcl2 cDNA分别克隆于pMigR1质粒的Nco I和Sal I之间，即在内部核糖体进入位点(IRES)下游，见图1。利用点突变试剂盒(Transformer,CLONTECH)，把第568位(人Bcl2为第577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA。通过对cDNA测序进行验证突变点，验证正确无误后，即得到所需要的去掉尾部47个氨基酸残基的突变Bcl2(△Bcl2)的基因序列，包含有该△Bcl2质粒为pMigR1‑△Bcl2(包含人△Bcl2的质粒为pMigR1‑△hBcl2)。再通过同样的方法把对应于第69位的苏氨酸残基T密码子和第70位、84位(人Bcl2对应的为第87位)的丝氨酸残基S密码子突变成谷氨酸残基E密码子，每个突变点通过对cDNA测序进行验证，验证正确无误后，即得到所需要的T69E/S70E/S84E(人Bcl2为T69E/S70E/S87E)并去掉尾部EEE EEE47个氨基酸残基的模拟磷酸化的突变小鼠Bcl2(△Bcl2 )和突变人Bcl2(△hBcl2 )的基EEE EEE EEE
因序列，包含有该△Bcl2 和△hBcl2 质粒分别为pMigR1‑△Bcl2 和pMigR1‑△EEE WT WT
hBcl2 。以没有去尾部氨基酸残基的野生型小鼠Bcl2(Bcl2 )和人Bcl2(hBcl2 )和模拟EEE EEE WT
磷酸化的突变小鼠Bcl2(Bcl2 )和人Bcl2(hBcl2 )构建的pMigR1‑Bcl2 、pMigR1‑WT EEE EEE
hBcl2 和pMigR1‑Bcl2 、pMigR1‑hBcl2 作为对照质粒。
[0019] 实施例2：构建含有上述点突变小鼠Bcl2和大于4.3kb基因的双顺反子逆转录病毒表达载体
[0020] 取pMigR1质粒进行BglII/SalI酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯pMigR1酶切片段；合成5’GATCTCTCGAGGCGGCCGCCAATTGG3’和5’TCGACCAATTGGCGGCCGCCTCGAGA3’，退火后与pMigR1酶切片段进行连接，以导入多克隆酶切位点BglII‑XhoI‑NotI‑MunI‑SalI，连接好后转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即得pMigR1‑△GFP质粒。
[0021] 以pMigR1质粒为模板，PCR扩增GFP基因，在5’端引物中引入BglII酶切位点和Kozak序列GCCACC，在3’端引物中保留SalI酶切位点。PCR后提纯PCR产物，然后用BglII/SalI进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯GFP片段。另以HSQ/AvrII/RENEO质粒为模板，PCR扩增B区域删除的凝血因子八(BDD FVIII)基因，5’端引物保留XhoI酶切位点，3’端引物引入MunI酶切位点。PCR后提纯PCR产物，然后用XhoI/MunI进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯BDD FVIII片段。全长人凝血因子八(FVIII)通过合成获得，两端引入XhoI/MunI酶切位点，用XhoI/MunI酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯FVIII片EEE EEE WT
段。pMigR1‑△Bcl2 、pMigR1‑Bcl2 和pMigR1‑Bcl2 用BglII/EcoRI和XhoI/EcoRI切开多EEE EEE WT
克隆酶切位点，pMigR1‑△hBcl2 、pMigR1‑hBcl2 和pMigR1‑hBcl2 用XhoI/EcoRI切开多克隆酶切位点，pMigR1‑△GFP用XhoI/MunI切开多克隆酶切位点，琼脂糖胶电泳进行分离纯化。把上述分离纯化好的GFP基因片段、BDD FVIII基因片段分别与BglII/EcoRI切开的三个质粒片段放在一起进行连接反应；另把BDD FVIII或FVIII基因片段分别与XhoI/EcoRI切开的六个质粒片段以及XhoI/MunI切开的pMigR1‑△GFP质粒片段放在一起进行连接反应。连接好后转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即EEE EEE EEE
得pMigR1‑△Bcl2 ‑GFP‑BDD FVIII、pMigR1‑△Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑△Bcl2 ‑EEE EEE
FVIII、pMigR1‑△hBcl2 ‑FVIII逆转录病毒表达载体质粒以及对照pMigR1‑Bcl2 ‑GFP‑EEE EEE WT
BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑FVIII和pMigR1‑Bcl2 ‑GFP‑BDD WT WT EEE
FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑WT
hBcl2 ‑FVIII逆转录病毒表达载体质粒(见图1A)和pMigR1‑△GFP‑BDD FVIII、pMigR1‑△GFP‑FVIII逆转录病毒表达载体质粒(见图1B)，其中目的基因大小均超过4.3kb。
[0022] 实施例3：转染HEK293细胞并表达大于5kb的融合基因GFP
[0023] 取二块六孔细胞培养板，在其中九孔中进行人胚肾来源的HEK293细胞培养，具体培养基为DMEM添加15％胎牛血清、2mM L‑谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70‑80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的DMEM培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的DMEM培养基，放在培EEE EEE养箱中待用。分别取上述提纯好的pMigR1‑△Bcl2 ‑GFP‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑GFP‑WT
BDD FVIII和pMigR1‑Bcl2 ‑GFP‑BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI‑MEM培养基中，混匀；另取3个1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的OPTI‑MEM培养基，然后在每管OPTI‑MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI‑MEM溶液与溶有脂质体的OPTI‑MEM溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种DNA质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的DNA脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养24小时，再换新鲜完全培养基2.5毫升/孔，培养24小时后上荧光显微镜观察GFP蛋白表达量。GFP表达量见附图2，图中显示，经过了第568位(人Bcl2为第577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘EEE
氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA后，△Bcl2 与连接了BDD FVIII基因的GFP在一个mRNA链共表达后，能极大促进该GFP的表达。
[0024] 实施例4转染HEK293细胞并表达BDD FVIII和FVIII基因
[0025] 取四块六孔细胞培养板，进行人胚肾来源的HEK293细胞培养，具体培养基为DMEM添加15％胎牛血清、2mM L‑谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70‑80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的DMEM培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的DMEM培养基，放在培养箱中待用。分EEE EEE别取上述提纯好的pMigR1‑△Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII和pMigR1‑WT EEE EEE WT
Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑△hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑△GFP‑BDD FVIII、pMigR1‑△GFP‑FVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI‑MEM培养基中，混匀；另取3个
1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的OPTI‑MEM培养基，然后在每管OPTI‑MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI‑MEM溶液与溶有脂质体的OPTI‑MEM溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。
从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种DNA质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置
20分钟的DNA脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养48小时，取上清液，用Coatest FVIII试剂盒(Chromogenix)根据试剂盒操作说明书来测试不同细胞上清液中的FVIII含量。结果如下：
EEE EEE WT
转染pMigR1‑△Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII、EEE EEE WT
pMigR1‑△hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑△GFP‑BDD FVIII、pMigR1‑△GFP‑FVIII的细胞上清液中的FVIII含量分别为85.31±28.65mU/ml、
37.57±8.59mU/ml、29.98±6.32mU/ml、13.93±3.22mU/ml、5.48±1.26mU/ml、3.80±
0.84mU/ml、2.11±0.57mU/ml、0.84±0.28mU/ml。从结果可知，经过了第568位(人Bcl2为第
577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA后，与目的基因BDD FVIII或FVIII在一个mRNA链共表达后，不管EEE EEE EEE
是小鼠△Bcl2 还是人△hBcl2 均能显著促进该目的基因的表达(pMigR1‑△Bcl2 ‑BDD EEE WT
FVIII与pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII、pMigR1‑Bcl2 ‑BDD FVIII和pMigR1‑△GFP‑BDD FVIIIEEE EEE WT
相比，p<0.05；pMigR1‑△hBcl2 ‑FVIII与pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII、pMigR1‑hBcl2 ‑FVIII和pMigR1‑△GFP‑FVIII相比，p<0.01)。
[0026] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
[0027] 序列表
[0028] 1、第568位碱基G突变为T的小鼠Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.1：
[0029] ATGGCGCAAGCCGGGAGAACAGGGTATGATAACCGGGAGATCGTGATGAAGTACATACATTATAAGCTGTCACAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGATGCGGACGCGGCGCCCCTGGGGGCTGCCCCCACCCCTGGCATCTTCTCCTTCCAGCCTGAGAGCAACCCAATGCCCGCTGTGCACCGGGACATGGCTGCCAGGACGTCTCCTCTCAGGCCCCTCGTTGCCACCGCTGGGCCTGCGCTCAGCCCTGTGCCACCTGtGGTCCATCTGACCCTCCGCCGGGCTGGGGATGACTTCTCTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCGCAGAGATGTCCAGTCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGAGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAACTCTTCAGGGATGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACAGGgAGATGTCACCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCATCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTATATGGCCCCAGCATGCGACCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACCCTGCTCAGCCTGGCCCTGGTCGGGGCCTGCATCACTCTGGGTGCATACCTGGGCCACAAGTGA
[0030] 2、第568位碱基G突变为T和第69、70、84位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的小鼠Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.2：
[0031] ATGGCGCAAGCCGGGAGAACAGGGTATGATAACCGGGAGATCGTGATGAAGTACATACATTATAAGCTGTCACAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGATGCGGACGCGGCGCCCCTGGGGGCTGCCCCCACCCCTGGCATCTTCTCCTTCCAGCCTGAGAGCAACCCAATGCCCGCTGTGCACCGGGACATGGCTGCCAGGGAGGAACCTCTCAGGCCCCTCGTTGCCACCGCTGGGCCTGCGCTCGAACCTGTGCCACCTGTGGTCCATCTGACCCTCCGCCGGGCTGGGGATGACTTCTCTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCGCAGAGATGTCCAGTCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGAGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAACTCTTCAGGGATGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTCACCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCATCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTATATGGCCCCAGCATGCGACCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACCCTGCTCAGCCTGGCCCTGGTCGGGGCCTGCATCACTCTGGGTGCATACCTGGGCCACAAGTGA
[0032] 3、第577位碱基G突变为T的人Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.3：
[0033] ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGACCTCGCCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCAGCCCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
[0034] 4、第577位碱基G突变为T和第69、70、87位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的人Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.4：
[0035] ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGGAGGAACCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCGAACCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
