[0041] 福氏完全佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0042] 其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
[0043] 本发明涉及到的各溶液的制备方法为:
[0044] PBS缓冲液:称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H2O 0.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL,即可得到0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲液;
[0045] PBST溶液:在1000mL PBS中加入500μL Tween-20,混合均匀;
[0046] 包被缓冲液CB:称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL;即可得到0.05mol/L pH=9.6的包被缓冲液;
[0047] 邻苯二胺底物液:称取1.85g Na2HPO4·12H2O、0.51g C6H8O7溶解于蒸馏水中并定容至50mL,称取4mg邻苯二胺溶于10mL上述溶液中,临用前加入15μL 30%H2O2;
[0048] 1wt%酪蛋白:称取1mg酪蛋白溶于1mL 0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲液中,混合均匀。
[0049] 1%牛血清白蛋白溶液:1g牛血清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲液中,混合均匀;
[0050] 1%鸡卵清白蛋白溶液:1g鸡卵清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲液中,混合均匀;
[0051] 实施例1
[0052] 一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法,包括以下步骤:
[0053] a、制备Fe3O4@O-dextran包被抗原和免疫原;
[0054] Fe3O4@O-dextran的制备参照文献J.Phys.Chem.C 2012,116,20558-20563公开的方法,其具体步骤如下:
[0055] 取0.5g葡聚糖40(Mw=40000)溶解在10mL去离子水中,然后加入7.5mL NaIO4(0.4g)水溶液,在80℃搅拌30分钟,移除加热器加入5mL的乙二醇阻止葡聚糖进一步氧化,最后用NaOH溶液调节pH为7;
[0056] FeCl3·6H2O(1mmol)和Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O(2mmol)混合溶解在10mL去离子水中,然后与氧化葡聚糖溶液混合,快速加入5mL NaOH(0.6g)溶液大力搅拌10分钟,转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中,160℃水热处理10h,最后冷却到室温离心或磁分离收集。即可得到Fe3O4@O-dextran。
[0057] Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中,然后加入0.1mL浓度为1mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液,震荡15~30min,加入0.2mL 1%牛血清白蛋白溶液(10mg/mL),25℃反应2~4h,将所得溶液装入透析袋中,用蒸馏水4℃透析12h收集,即得到Fe3O4@O-dextran免疫原;
[0058] Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中,然后加入0.1mL浓度为1mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液,震荡15~30min,加入0.2mL 1%鸡卵清白蛋白溶液(10mg/mL),25℃反应2~4h,将所得溶液装入透析袋中,用蒸馏水4℃透析12h收集,即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原;
[0059] 所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液。
[0060] b、制备Fe3O4@O-dextran抗体;
[0061] 取4只体重2~2.5kg健康的雄性新西兰大白兔,其中一只作为空白对照,其他三只作为实验兔,空白对照组不做任何处理。
[0062] 实验组的处理方法为:
[0063] 将弗氏完全佐剂与Fe3O4@O-dextran免疫原按照体积比1:1混合乳化均匀,在雄性新西兰大白兔背部皮下注射约8~10个点,总量共1mL/只。疫接种的方式有注射免疫、口服免疫、气雾免疫等,其中注射免疫又有皮下注射、皮内注射、肌肉注射静脉注射等方式,背部皮下注射操作方便,药物扩散较慢,有利于刺激机体产生免疫应答,继而产生抗体;而雄兔作为免疫对象可以避免其生理周期对实验产生影响。
[0064] 首次免疫三周后进行加强免疫,加强免疫是将弗氏不完全佐剂和Fe3O4@O-dextran免疫原按照体积比1:1混合均匀,注射过程同首次免疫注射一样,每次加强免疫之间间隔两周,中间周采血用间接竞争酶联免疫分析法测定抗血清的效价,直到抗体效价达到1:64000,进行最后一次加强免疫,对新西兰大白兔颈动脉采血,进行血清的纯化和分离,将得到的抗体储存在-80℃或-25℃待用。
[0065] 弗氏不完全佐剂的制备是将液体石蜡和羊毛脂按照用量比2:1,即液体石蜡100mL,羊毛脂50g混合,用超声仪分多次超声,每次超声半小时冷却到室温,再继续超声,这样反复乳化混合,直到滴一滴混合物于冰水混合液中半分钟不扩散即为弗氏不完全佐剂制备成功。
[0066] 抗血清效价的测定方法为:将Fe3O4@O-dextra包被抗原用包被缓冲液(CB)稀释50倍包被在96孔酶标板上过夜。第二天早上取出,用洗涤液(PBST)洗涤3次,每次3min,加入1wt%酪蛋白200μL/孔,37℃温育1h。待1h之后取出,用PBST洗涤3次,每次3min,加入用PBS稀释一系列稀释比1/2000~1/256000的抗血清,100μL/孔,37℃温育2h。待2h之后取出洗涤
3次,每次3min,加入用PBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔抗体lgG 100μL/孔,
37℃温育2h。待2h之后取出洗涤3次,每次3min,加入底物液100μL/孔,37℃反应30min。
30min之后取出加入2mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应。用酶标仪测定490nm处的吸光度值。比较实验组与空白对照组在同一抗血清稀释倍数下的吸光值A,当A实验组≥2倍A对照组时对应的最大稀释倍数即抗血清的效价。
[0067] c、间接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran
[0068] c-1、包被:用包被缓冲液将Fe3O4@O-dextran包被抗原稀释200倍,包被于96孔酶标板中的24个孔中,即每行取3个孔进行实验,每孔100μL,冰箱4℃过夜;
[0069] c-2、封闭:PBST洗涤三次,每次3min拍干,加入1wt%酪蛋白200μL/孔进行封闭(减少非特异性吸附),37℃温育1h;
[0070] c-3、加样竞争:PBST洗涤3次,每次3min,将50μL浓度分别为0.0232ng/mL、0.232ng/mL、2.32ng/mL、23.2ng/mL、232ng/mL、2320ng/mL的Fe3O4@O-dextran标准液依次加入到酶标板的各行中,即每个浓度梯度重复三次,然后向各孔中加入50μL Fe3O4@O-dextran抗体,37℃温育2h;
[0071] 不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液的制备方法为:用0.01mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液将Fe3O4@O-dextran稀释到指定的浓度;
[0072] c-4、加酶:PBST洗涤3次,每次3min,每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔抗体IgG,37℃温育3h;
[0073] c-5:显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3min,然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应,37℃温育30min;
[0074] c-6、终止:每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应,在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度值,同一浓度梯度的取平均值计算吸光度值;
[0075] d、以Fe3O4@O-dextran标准液浓度的对数为横坐标,吸光度值为纵坐标建立标准曲线,所得标准曲线的线性方程为:A=1.17651-0.07137lgC,相关系数R=-0.9991,线性范围-2 3为2.32×10 ~2.32×10,检出限为0.0297ng/mL。
[0076] e、重复以上各步骤,只是将步骤c-3中的不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液替换为未知浓度的Fe3O4@O-dextran待测液,然后在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度值,求取平均吸光度值,根据上述标准曲线A=1.17651-0.07137lgC,即可计算出Fe3O4@O-dextran待测液的浓度。
[0077] 以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法,此方法所得到的标准曲线的线性关系最好,线性范围最宽。
[0078] 上述参照实施例对氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。