[0023] 下面结合实施例对本发明作详细的说明。
[0024] 实施例1：表达质粒及表达工程菌的构建
[0025] a、将SEQ ID NO:1所示的碱基序列estB'交由金斯瑞生物科技公司合成；
[0026] b、将SEQ ID NO:1所示的碱基序列estB'与载体pET28b连接，构建具有Kan抗性的表达质粒pET28b‑estB'；即将基因estB'序列和载体pET‑28b(+)分别进行Nde I和Xho I对应酶切，酶切条件为37℃，反应6h。将双酶切的基因estB'与载体pET‑28b(+)进行连接，构建表达质粒pET28b‑estB'，连接条件为16℃反应过夜。
[0027] c、取出冻存的大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)，冰浴复苏，10min，直至融化取100μl复苏后的细胞，加入到含10μl质粒pET28b‑estB'的EP管中，轻旋混匀内容物，冰浴
30min，中间轻摇数次，防止菌体沉淀；42℃热休克90s，避免摇动；冰浴5min；加500μlLB培养液，摇床37℃振荡培养1～2h，得到转化的菌体；吸取转化的菌体100μl，涂布于含有卡那霉素Kan和氯霉素Cam抗性的LB固体平板上，待平板表面的菌液被吸收后，放入37℃恒温培养箱倒置培养过夜。平板上长出的菌落即为具Kan和Cam双重抗性的重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b‑estB'。
[0028] 实施例2：EstB的表达和纯化
[0029] 挑取实施例1所制的重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b‑estB'于含Kan和Cam抗性的5ml LB液体培养基的试管中，37℃，225rpm，过夜扩大培养；培养物以1:100接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃，225rpm，振荡培养至OD600为0.6时；加入0.01‑0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl‑β‑D‑thiogalactopyranoside，IPTG)，16℃诱导表达24h；
2+
4℃，5,000rpm，离心5min，收集菌体，超声波破碎；用Co 离子亲和柱纯化，并对纯化蛋白进行蛋白质浓度检测，以牛血清蛋白为标准，纯化后的酯酶蛋白浓度为0.786mg/ml。依据酯酶EstB的氨基酸组成，该蛋白质共有418个氨基酸组成，分子量(Molecular weight)为
43.79kDa，等电点(Isoelectric point)为5.92，脂肪族氨基酸指数(Aliphatic index)为
92.97％。
[0030] 实施例3：EstB酶活检测的标准体系
[0031] EstB酶活检测标准体系为1ml，980μl50mMTris‑HCL(pH 9.0)，10μl0.5mM的对硝基苯酚丁酸酯，10μl纯酶液，使用可以自动控温的Cary 300UV分光光度计，检测波长为410nm。反应温度25℃，反应时间5min。
[0032] 实施例4：EstB最适pH值试验
[0033] 除在相应的pH范围使用对应的缓冲液：pH 6.0‑7.0，50mMSodiumcitratebuffer；pH 7.0‑9.0，50mMTris‑HCl buffer；pH 9.0‑10.5，50mM K2HPO4‑NaOH buffer，外，其余与标准条件相同，试验独立重复3次，结果如图1所示，EstB的最适pH是9.0。
[0034] 实施例5：EstB最适温度试验
[0035] 除设置反应温度(10℃‑60℃)，外，其余与标准条件相同，试验独立重复3次，取平均值。结果如图2所示，表明该酶的最适温度是55℃。
[0036] 实施例6：EstB热稳定性检测
[0037] 将实施例2所制的EstB蛋白在55℃和100℃分别温育一定时间，采用标准检测体系，25℃检测残余酶活，确定热稳定性，以未处理的纯酶活性设为100％。结果如图3所示，该酶在55℃条件下放置175h酶活性仍无明显变化，100℃下EstB放置6h残余酶活在60％以上，8h后酶活仍在30％以上，表明该酶具极强的热稳定性。
[0038] 实施例7：EstB最适底物测定
[0039] 采用标准的测定体系，测定相同浓度不同链长(C4‑C16)对硝基苯酚酯类底物的比活力。一个酶活单位(U)的定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量，重组酶活通过对硝基苯酚标准曲线计算得出。酶的比活力(U/mg)指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。结果如表1所示：当底物为对硝基苯酚乙酸酯时酶的比活力最高，达81.6U/mg。
[0040] 表1酯酶EstB的比活力
[0041]Compounds Specific activity(U/mg)±SD
pNPA2 81.6±1.0
pNPB4 67.2±2.2
pNPC6 55.8±1.4
pNPC8 28.8±1.1
pNPC10 19.2±0.4
pNPL12 15.7±0.2
pNPM14 13.4±0.7
pNPP16 12.7±0.5
[0042] 实施例8：EstB酶活受金属离子、EDTA和PMSF(苯甲基磺酰氟)的影响。
[0043] 采用标准测定体系，分别添加金属离子、EDTA和PMSF检测EstB酶活力，所用缓冲液终浓度为50mM Tris‑HCl，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表2：
[0044] 表2EstB活受金属离子、EDTA和PMSF的影响
[0045]
[0046] 如表2所示：1mM的Mn2+对酶最强的激活效应，可使酶活提高至145.7％，随Mn2+浓度2+
增加，10mM的Mn 对酶的激活作用略有降低，仍可使酶活提高至131.9％；在所有被检测的金
3+ + + 2+
属离子中，大多数金属离子随其浓度增加酶活性降低，但Fe 、K 、Na、Ca 当其浓度从1mM增
2+ 2+
至10mM时，酶活性有一定程度的增加，Mg 随其浓度增加酶活无明显影响；10mM的Ni 对酶的抑制作用最强，可使酶活性降低至11.6％；1mM及10Mm EDTA对EstB催化活性无明显影响；
PMSF对酯酶有一定程度的抑制作用，1mM及10Mm的PMSF可分别使酶活降低至65.2％和
55.0％。
[0047] 实施例9：EstB酶活受有机溶剂的影响。
[0048] 采用标准测定体系，分别检测不同有机试剂对酶活的影响，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表3：
[0049] 表3EstB活性受有机溶剂的影响
[0050]
[0051] 所有被检测的有机溶剂均对酯酶EstB的酶活产生抑制作用，且随含量增加对酶活性的抑制作用增强。含量为15％的乙醇对酶活的抑制作用最小，仅降低至93.7％；酯酶EstB对甲醇、二甲基甲酰胺、异丙醇也具一定的耐受作用，该三种有机溶剂体积占比15％时，EstB的酶活仍可保持在80％以上。
[0052] 实施例10：EstB酶活受去垢剂的影响。
[0053] 采用标准测定体系，分别检测不同去垢剂对酶活性的影响，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表4：
[0054] 表4EstB活性受去垢剂的影响
[0055]
[0056] CTAB为十六烷基三甲基溴化铵。
[0057] Tween‑80对EstB的酶活有高效的激活作用，0.1％和1％的Tween‑80分别可使酶活性性提高63.3％和39.6％。0.1％的Tween‑20可使酶活提高12.8％，0.1％的Span‑20和SDS对酶活无明显影响，0.1％的Triton X‑100和CTAB对酶活有一定程度的抑制作用；随着去垢剂浓度的提高，当体积比提高至1％时酶的活性均有所降低，其中CTAB和SDS对酶的抑制作用最强，均可使酶活下降至30％。
