[0026] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
[0028] 下述实施例中的玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759均记载在文献(Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number of vascular bundle in maize stem，J Integr Plant Biol.2016Jan；58(1):81‑90.doi:10.1111/jipb.12358.Epub 2015Jul 16.)中，玉米野生近缘种CIMMYT 8759为该文献中的CIMMYT accession 8759，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0029] 下述实施例中的MR0131为美国玉米种质资源中心(Maize Genetics Cooperation Stock Center)产品，网址为：www.maizecoop.cropsci.uiuc.edu，公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。MR0131为由玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759通过杂交、回交和自交衍生得到的渗入系材料。公众可从申请人处获得玉米自交系W22，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0030] 实施例1、与玉米叶绿素含量相关的分子标记
[0031] 本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定玉米叶绿素含量的分子标记CHL1(记为玉米叶绿素含量分子标记)，该分子标记为以玉米基因组DNA为模板，利用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA片段，所得DNA片段的序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。引物对A1序列如下：
[0032] 正向扩增引物Chl1‑F：5’‑TGCATCCCACTTCTCTTCACT‑3’，如SEQ ID No.1所示；
[0033] 反向扩增引物Chl1‑R：5’‑TCCCTTGAAGCTTAAAGTGACA‑3’，如SEQ ID No.2所示。
[0034] 以叶绿素含量较低的玉米自交系W22和叶绿素含量较高的玉米野生近缘种CIMMYT8759的基因组DNA为模板，用引物对A1进行PCR扩增，检测所得PCR产物的序列。
[0035] 其中，PCR扩增的反应体系为10μL，包括：
[0036] (1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
[0037] (2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
[0038] (3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
[0039] (4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012‑01)；
[0040] (5)2μL ddH2O。
[0041] PCR扩增的程序如下：
[0042] (1)95℃预变性10min；
[0043] (2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；
[0044] (3)72℃延伸10min；
[0045] (4)4℃保存。
[0046] PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
[0047] 将PCR扩增产物在3.0％的琼脂糖凝胶(每100mL凝胶溶液中含有3.0g琼脂糖)中进行电泳分离并进行测序分析，结果显示，以玉米自交系W22的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为246bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；以玉米野生近缘种CIMMYT 8759的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为166bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0048] 其中，玉米野生近缘种CIMMYT 8759的扩增带型为增加叶绿素含量的优异等位基因。所以，如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为166bp，则该待测玉米样品含有提高玉米叶绿素含量的等位基因；如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为246bp，则该待测玉米样品含有降低玉米叶绿素含量的等位基因。
[0049] 将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列比对后发现，与高叶绿素含量的玉米样品相比，低叶绿素含量的玉米样品在107bp的位置有80bp的核苷酸插入(图1)。玉米自交系W22和玉米野生近缘种CIMMYT 8759的PCR扩增产物的电泳结果如图2所示。
[0050] 实施例2、分子标记CHL1的获得方法
[0051] 分子标记CHL1的获得方法具体包括以下步骤：
[0052] 步骤1：构建包含866个家系的BC2S3渗入系群体
[0053] 以玉米自交系W22作为受体亲本，以玉米野生近缘种CIMMYT 8759作为供体亲本，通过杂交1代，回交2代，自交3代得到包含866个家系的BC2S3渗入系群体。
[0054] 步骤2：渗入系群体的田间种植与表型测定
[0055] 2019年春季在湖南省浏阳市(28.2°N,113.6°E)国家农作物品种区域试验站种植该渗入系群体。田间试验采用扩增式不完全随机区组设计，每个小区种植2行，每行种植15株，株距25cm。每垄种植2个家系，垄高15cm，垄宽70cm，沟宽30cm。
[0056] 在玉米开花期使用便携式叶绿素测定仪(SPAD‑502Plus,Konica Minolta,Japan)测定植株穗位叶的SPAD值。每个家系选择长势一致的5个单株，测定每个单株穗位叶1/2位置的SPAD值，每个单株重复测定3次，3次测定的均值作为该植株穗位叶的叶绿素含量，5个单株SPAD值的均值作为该家系穗位叶的叶绿素含量。
[0057] 步骤3：进行QTL定位分析
[0058] 利用R/qtl的多QTL模型进行QTL定位分析。首先应用Haley‑Knott回归进行QTL简单区间定位分析，并采用置换检验10000次的方法确定叶绿素含量QTL的LOD阈值(α＝0.05)。将简单区间定位得到的QTL模型进行多QTL模型拟合，并利用R/qtl的refineqtl命令优化每个QTL的位置。进一步利用addqtl命令检测基因组是否存在其他显著改善模型的QTL，如果检测到新的QTL，则重新拟合多QTL模型和优化QTL位置，重复此过程，直到检测不到新的QTL。最后利用fitqtl命令计算所有QTL解释的总表型变异及单个QTL的加性效应和表型贡献率。
[0059] QTL定位结果分析：共检测到10个控制玉米叶绿素含量的QTL，其中在第1染色体上检测到一个表型效应最大的QTL qChl1‑1。qChl1‑1的LOD值为10.78，加性效应大小为2.14，显性效应大小为‑0.81，表型贡献率为4.04％，位于玉米第1染色体25411083bp至27638632bp区间内。
[0060] 步骤4：分子标记CHL1的开发与合成
[0061] 利用在线引物设计软件primer3(https://primer3.ut.ee/)对qChl1‑1在第1染色体25411083bp至27638632bp的物理区间进行搜索，设计正向扩增引物Chl1‑F和反向扩增引物Chl1‑R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，核苷酸序列如下：
[0062] 正向扩增引物Chl1‑F：5’‑TGCATCCCACTTCTCTTCACT‑3’，如SEQ ID No.1所示；
[0063] 反向扩增引物Chl1‑R：5’‑TCCCTTGAAGCTTAAAGTGACA‑3’，如SEQ ID No.2所示。
[0064] 实施例3、分子标记CHL1的应用
[0065] 以仅在qChl1‑1区段杂合，而在基因组其他位点纯合的渗入系MR0131为起始材料并进行自交授粉，产生一个仅在qChl1‑1区段分离的F2群体。以包含192个单株的F2群体为材料对本发明获得的分子标记CHL1进行验证，以确定该分子标记应用于分子标记辅助选择育种的准确性。具体包括以下步骤：
[0066] 步骤1：F2群体叶绿素含量的测定
[0067] 按照实施例2的方法测定F2群体植株的叶绿素含量。
[0068] 步骤2：采用CTAB法提取玉米叶片DNA。
[0069] 步骤3：PCR扩增
[0070] PCR扩增的反应体系为10μL，包括：
[0071] (1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
[0072] (2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
[0073] (3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
[0074] (4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012‑01)；
[0075] (5)2μL ddH2O。
[0076] PCR扩增的程序如下：
[0077] (1)95℃预变性10min；
[0078] (2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；
[0079] (3)72℃延伸10min；
[0080] (4)4℃保存。
[0081] PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
[0082] 步骤4：电泳
[0083] 分子标记CHL1在部分F2单株中PCR扩增产物的电泳图谱如图3所示。
[0084] 步骤5：结果分析
[0085] 根据PCR扩增产物的分子量大小确定待测玉米样品的基因型：如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条246bp的条带，则该待测玉米含有纯合的W22基因型(即与玉米自交系W22相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条166bp的条带，则该待测玉米含有纯合的CIMMYT 8759基因型(即与玉米野生近缘种CIMMYT 8759相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物不仅有一条246bp的条带，而且还有一条166bp的条带，则该待测玉米为杂合基因型。
[0086] F2单株中共有38株为纯合的W22基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.3，38株纯合的W22基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为41.34±6.01；共有40株为纯合的CIMMYT 8759基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.4，40株纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为46.65±6.08；共有114株为杂合基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，114株杂合基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为43.64±5.03。
[0087] 进一步对各组的叶绿素含量表型值进行方差分析(图4)。结果表明：纯合的W22基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，纯合的W22基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于杂合基因型F2单株，杂合基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，说明分子标记CHL1与玉米叶片的叶绿素含量相关，具有重要的育种应用价值。
[0088] 综上所述，本发明提供的分子标记CHL1与qChl1‑1紧密连锁，可以快速准确地鉴定出玉米叶绿素含量，能够促进该位点在玉米新品种选育中的应用，也有利于该位点与其它优良性状位点的分子聚合育种。通过本发明提供的方法，在玉米任何阶段均可鉴定和筛选玉米种质资源的叶绿素含量，具有简便、快速、高效、准确的优点，适于大规模推广应用。
[0089] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
