[0004] 为克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。该方法可实现即简单、大量人工培养繁殖线虫，又长期保存线虫资源的目的。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，包含以下步骤：
[0006] （1）甘薯愈伤组织的制备：将新鲜健康的甘薯洗净晾干，用酒精浸泡后，灼烧，至表皮变暗，削去表皮，切成甘薯片，放入灭菌培养皿中，封口，于22～28℃暗培养至长出甘薯愈伤组织；
[0007] （2）植物寄生线虫的消毒和接种：挑取或吸取植物寄生线虫，消毒，然后离心，去除上清，将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心，去除上清，最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分散滴在甘薯愈伤组织上，封口；
[0008] （3）植物寄生线虫的繁殖培养：将步骤（2）中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组织进行暗培养繁殖，培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度；
[0009] （4）植物寄生线虫的保存：将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于4～20℃保存；
[0010] 步骤（1）中所述的酒精选用工业酒精即可，其浓度优选为质量百分比70%；
[0011] 步骤（1）中所述的浸泡的时间优选为2min；
[0012] 步骤（1）中所述的甘薯片的厚度根据培养皿的厚度，以距离皿盖至少5mm为宜，优选厚度为4mm，太厚靠近皿盖，不易于接种，太薄容易缺失水份，薯块易干，不易于长期培养、繁殖率低；
[0013] 步骤（1）中所述的培养皿可以是多种规格，优选直径为6cm的培养皿；培养皿大太占用空间，太小则只放较小的薯块，不利于提高线虫的繁殖率，此外，6cm的培养皿便于保存；
[0014] 步骤（1）中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口；
[0015] 步骤（1）中所述的暗培养的温度更优选为25℃；
[0016] 步骤（1）中所述的于22～28℃暗培养至长出甘薯愈伤组织的时间一般为10～15天；
[0017] 步骤（2）中所述的植物寄生线虫优选为腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）；
[0018] 步骤（2）中所述的消毒优选为使用质量百分比0.2%的硫酸链霉素溶液处理3～12h，可以达到消毒目的，不影响其正常的繁殖发育；
[0019] 步骤（2）中所述的离心的条件优选为4000rpm离心2min；
[0020] 步骤（3）中所述的培养温度要根据被培养繁殖的植物线虫种类的生物学特性确定；因为植物寄生线虫不同属、种间的生物学特性存在差异，最合适的生长温度有所不同；
[0021] 当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时，所述的培养温度为20～25℃；
[0022] 当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时，所述的培养温度为17～20℃；
[0023] 当所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的培养温度为25～30℃；
[0024] 步骤（4）中所述的植物寄生线虫优选为在甘薯愈伤组织上培养50天的植物寄生线虫；
[0025] 步骤（4）中所述的保存的温度如下：所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫和起绒草茎线虫时，所述的保存的温度为4℃；所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时，所述的保存的温度为20℃；
[0026] 上述利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，包括线虫继代培养的步骤，是在接种扩繁线虫的甘薯愈伤组织培养皿中加入无菌水，然后挑出或吸取线虫，重复步骤（2）和（3）即可达到继代培养之目的。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：目前，利用甘薯愈伤组织繁殖和培养保存腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）这3种植物寄生线虫的方法尚未有报道。本专利发明利用无培养基培养的甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，操作简单、成功率和繁殖率高，并且也可以实现对这3种线虫的更长时间的保存。本发明的方法既可实现简单、大量繁殖腐烂茎线虫、起绒草茎线虫和香蕉穿孔线虫，又能长期培养保存这些线虫，具体如下：
[0028] （1）使用甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，与真菌培养方法相比，操作方法更加简便，培养材料更易获得；培养一段时间的线虫比较容易聚集在培养皿底部，容易收集干净的线虫；此外，腐烂茎线虫和起绒草茎线虫属于植物寄生线虫，长期在真菌上培养会导致其对植物寄生和致病力的退化，在甘薯愈伤组织长期培养则能避免此情况发生。
[0029] （2）使用无需培养基培养的甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，与用培养基培养的苜蓿愈伤组织培养这两种线虫的方法相比，操作步骤简单，对人员操作要求低，省时、省力，且成功率高。主要表现在：1）本发明不需要配制培养基；2）甘薯愈伤组织一般在7天就可以长出，10～15天则可以在薯块上长满薯块，但用培养基培养的苜蓿愈伤组织需要1个月；3）甘薯的切片规则，有一个愈伤组织平面，容易接种线虫，而苜蓿愈伤组织不规则，不易接种线虫；4）用培养基培养的苜蓿愈伤组织需要在非常严格的无菌条件下操作，很容易污染，而本发明操作简单，较少发生污染；5）这两种线虫在无培养基培养的甘薯愈伤组织上繁殖率高。
[0030] （3）使用甘薯愈伤组织培养香蕉穿孔线虫，与胡萝卜愈伤组织培养香蕉穿孔线虫相比，甘薯相比胡萝卜，含水量较少，较少滋生细菌，甘薯愈伤组织培养成功率高、不易腐烂、能长期培养保存。胡萝卜含水量较高，内部易感染细菌，很容易在切片消毒后在未长出愈伤组织前出现坏死斑或腐烂，不能用以培养线虫，浪费人力和物力；而培养出的愈伤组织接种香蕉穿孔线虫后，也因含水量较高，而较快腐烂，因此不能在同一块胡萝卜愈伤组织上长期培养保存香蕉穿孔线虫，需要较频繁的将香蕉穿孔线虫转接到新的胡萝卜愈伤组织上进行续培养保存，因此工作量大。
