一种与马铃薯耐寒性相关的分子标记与应用   0    0

[0001] 本发明涉及一种与马铃薯耐寒性相关的分子标记。

[0002] 我国南方水稻产区有3亿多亩的冬闲田，在冬闲田种植马铃薯是提高我国粮食安全水平的新的有效措施。我国冬作马铃薯的种植面积已经达到3000万亩以上。由于马铃薯喜温怕寒，而冬作马铃薯幼苗生长期多处于低温阴雨天气，且霜冻频发，常常导致冬作马铃薯生长期延迟和产量不稳定。所以，低温胁迫是伴随中国冬作马铃薯迅速发展，不同于其他马铃薯主产区所面临的全新科学问题。研究马铃薯的耐寒性鉴定技术，对马铃薯资源的合理应用和培育耐寒马铃薯品种以及耐寒性机理研究具有重要意义。

[0003] 由于根据单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)定位目的基因的准确性，SNP现已被广泛应用于园艺作物抗性基因定位。水稻高抗稻瘟病基因Pi-ta通过SNP标记被成功定位于水稻第12条染色体上[1-3]。王守用[4]等成功利用SNP开发了与大麦叶锈病抗性基因相关的标记基因Rph7，并应用于大麦抗叶锈病的资源筛选和育种。Laterrot等利用SNP标记将番茄抗枯萎病基因I-2定位于第11染色体的长臂上。徐薪惟等通过检测不同抗性的番茄I-2基因，筛选出两个与番茄抗枯萎病相关的SNP标记，研究发现这两个SNP导致亮氨酸序列出现重复，使番茄获得抗枯萎病性状。蓝莓[5]和小麦[6]也应用开发出的性状高相关性SNP分析成功进行了早代选择。目前，SNP在马铃薯上的开发还甚少。

[0004] CAPS，（cleaved amplified polymorphic sequence）CAPS[7]标记通过将特异PCR和限制性内切酶相结合进行多态性检测，具有共显性、位点特异性、操作简单和低成本的优点。并且通过简单 PCR、限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳即可完成。开发简便、高效、快速的 SNP 标记检测方法一直是 SNP 标记应用于植物遗传育种研究中首要解决的问题。基于相当一部分 SNP 位点都能导致酶切位点突变，这为高通量开发利用 CAPS 标记奠定了基础，大大促进 SNP 标记在植物遗传育种中的应用。本发明为马铃薯耐寒性资源CAPS分子标记辅助选择方法，在培育耐寒马铃薯品种或研究中具有重要意义。

[0005] 参考文献

[0006] [1]HITTALMANI S, PARCO A, MEW T, et al. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice [J]. TAG Theoretical and Applied Genetics. 2000, 100(7): 1121-1128.

[0007] [2]时克. 杂交稻恢复系明恢 63 抗稻瘟病新基因 Pimh (t) 的精细定位 [D]; 北京: 中国农业科学院. 2008.

[0008] [3]张羽, 张晓娟, 杨凤娇, 等. 水稻稻瘟病抗性基因 Pi-ta 的 SNP 检测方法 [J]. 中国水稻科学. 2013, 27(3): 325-328.

[0009] [4]王守用. 大麦 Gsp 基因 SNP 变异及其与籽粒硬度的关联性 [D]; 四川农业大学. 2009.

[0010] [5]刘肖. 蓝莓抗寒性, 需冷量 SNP 分析与分子辅助育种研究 [D]; 北京: 北京林业大学. 2013.

[0011] [6]王彩香. 小麦抗旱相关基因 TaABC1L 的克隆, 表达分析及 SNP 标记开发和定位 [D]; 山西大学. 2007.

[0012] [7]THIEL T, KOTA R, GROSSE I, et al. SNP2CAPS: a SNP and INDEL analysis tool for CAPS marker development [J]. Nucleic Acids Research. 2004, 
32(1): 578-586。

[0013] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种CAPS分子标记进行马铃薯耐寒性资源辅助选择的方法。

[0014] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种与马铃薯耐寒性相关的分子标记，正反向引物分别如下：引物F:5’ CTGCAGATGAATGCCGAT 3’ ，引物R: 5’ CCAGAAATGATCAGGCTG 3’ 。

[0015] 本发明还提供一种所述的分子标记检测马铃薯耐寒性的方法，所述方法以待分析马铃薯资源基因组DNA为模板，运用所述分子标记进行PCR扩增，扩增所得片段用限制性内切酶BstUI进行酶切，分析酶切产物多态性。

[0016] 上述的方法，所述的PCR扩增的反应体系，按50ul计，

[0017] 引物F  2.0ul

[0018] 引物R  2.0ul

[0019] 5×Fast Hifidelity PCR Buffer  10.0ul

[0020] Fast Hifidelity Polymerase  0.8ul

[0021] DNA模板  2.0ul

[0022] ddH2O补足50ul。

[0023] 上述的方法，所述的PCR扩增的反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃延伸10min。

[0024] 上述的方法，所述的分析酶切产物多态性是通过凝胶电泳进行分析。

[0025] 上述的方法，所述的酶切的反应体系如下：

[0026] 扩增DNA  1ul

[0027] 10×Buffer  2ul

[0028] BstU  1ul

[0029] ddH2O补足21ul。

[0030] 本发明的效果：

[0031] 该检测方法将筛选到的耐寒性SNP位点转化为CAPS标记，仅通过简单 PCR、限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳即可完成，处理方便、操作简单、重复性好，经济可靠。该方法能快速有效地进行马铃薯资源耐寒性评价，和辅助选择具有抗寒性的马铃薯品系，缩短育种进程，为马铃薯育种的发展提供一种新的育种体系。

[0036] 下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，以说明本发明的可靠性。但具体实施例并不对本发明做任何限定。

[0037] 实施例一

[0038] 试验Ⅰ：（S60620 SNP标记的获得）

[0039] 马铃薯材料：马铃薯工程技术研究中心多年以来收集的马铃薯材料共计54份材料，基质盆栽，基质采用商用蔬菜栽培土。

[0040] 材料低温处理：

[0041] 在苗龄达到60天时，植株长势较好，适合取样。每个材料取充分成熟的顶端无病虫害完整的功能叶片，用蒸馏水反复冲洗干净并用滤纸吸干叶片表面水分，将叶片放入50ml离心管中，封口。将离心管放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30min，向离心管中加入一小块冰，保持30min后取样。温度从0℃降至-1℃，保持1h后取样。温度从-1℃降至-2℃，保持1h后取样。依次类推，至温度达到-7℃。前后共取样八次。将取出的所有离心管放在冰上过夜解冻，根据试验设定测量相应指标。

[0042]  相对电导率测定求材料半致死温度

[0043] 浸泡法：取低温处理并过夜解冻离心管中的叶片，尽量保持叶片完整性，无烂叶，少含茎节。用蒸馏水反复冲洗数次洗干净叶片，并用滤纸吸干叶片表面水分，剪成适宜宽度（约0.3cm）的长条，迅速称量三份，每份0.2g，分别置于含20ml去离子水的试管中，封口，室温下去离子水浸泡处理12h后，用DDSJ-308A型电导率仪测定提取液沸水浴处理前电导率（R1），然后将试管置于水浴锅中沸水浴20min以杀死叶片，迅速冷却至室温，充分摇匀后测量浸提液电导率（R2）。相对电导率=R1/R2×100%。将每个温度对应的三次计算平均值与Logista方程拟合。方程拐点即为材料的半致死温度。结果如下：

[0044] 表1 试验材料半致死温度

[0045] 材料名称 半致死温度 材料名称 半致死温度 材料名称 半致死温度8033（9） -0.8℃ 41*7 -1.2℃ 21*15 -2.2℃
21*11 -1.0℃ 18*8 -1.2℃ 中薯3号 -2.3℃
41*5 -1.0℃ 8033（5） -1.2℃ 13*10 -2.3℃
41*9 -1.0℃ 16*4 -1.2℃ 8033（7） -2.3℃
21*13 -1.0℃ 41*2 -1.3℃ 18*6 -2.4℃
41*8 -1.1℃ 21*12 -1.4℃ BS214 -2.4℃
16*7 -1.1℃ 13*2 -1.6℃ BS226 -2.5℃
16*2 -1.1℃ 18*1 -2.1℃ 兴佳2号 -2.5℃
18*5 -1.1℃ 21*1 -2.1℃ 费乌瑞它 -2.6℃
21*19 -1.2℃ S4 -2.1℃ Yan2 -3.1℃
13*1 -1.2℃ 13*4 -2.2℃ Q304 -3.4℃
16*1 -1.2℃ 41*3 -2.2℃ GS393 -4.0℃
13*3 -1.2℃ 21*10 -2.2℃ AV9 -4.2℃
东农303 -2.1℃ 虎头 -2.1℃ 8033（4） -3.8℃
早大白 -2.5℃ 紫花白 -1.9℃ 南中552 -2.5℃
鄂薯5号 -2.1℃ 中薯5号 -2.5℃ 克新1号 -2.4℃
鄂薯10号 -2.2℃ 青薯10号 -1.8℃ 夏坡蒂 -1.6℃
大西洋 -1.8℃ 合作88 -1.7℃ 高原4号 -2.1℃

[0046]  抗寒性差异群体筛选

[0047] 根据半致死温度选取15份存在抗寒性差异的材料，原则上需包括抗寒性强的，不抗寒的，中间抗寒性能的材料。如下：Yan2、Q304、GS393和AV9；不抗寒品种41*2、16*7、18*5；中间性能品种S4、21*15、中薯三号、13*10、BS214、BS226、兴佳2号、费乌瑞它共计15个品种组成抗寒性差异群体。

[0048]  抗寒性状相关的EST库构建及比对分析

[0049] 在NCBI上输入关键词cold、potato，下载与之相关的所有序列，筛选其中与抗寒性关系密切的序列构建抗寒性相关的EST库备用序列，创建fasta文件；共计8739条序列，成功构建EST库。应用BLASTEN 2.2.25版本进行马铃薯抗寒性状相关功能的SNP标记的比对与筛选。

[0050]  差异群体简化基因组测序

[0051] 在所有30个样本的群体水平上总计检测到148,792个SNP；经过过滤（缺失率50%为标准，即每个位点至少有50%的样本有基因型，不少于15个样本有基因型，无缺失）；总计获得80,252个SNP。

[0052] 表2 双酶切所得SNP结果及注释统计

[0053] 样品名称 样品编号 SNP数量 非同义 同义 比率（%）41*2 A 1 31,344 2,406 2,424 0.99
41*2 B 2 31,061 2,366 2,371 1.00
中薯3号 A 3 27,073 2,156 2,244 0.96
中薯3号B 4 8,301 791 885 0.89
13*10 A 5 23,173 1,975 2,151 0.92
13*10 B 6 13,858 1,429 1,440 0.99
BS214 A 7 24335 2,202 2,366 0.93
BS214 B 8 13,412 1,414 1,509 0.94
兴佳2号 A 9 24,959 1,932 2,217 0.87
兴佳2号 B 10 15,689 1,342 1,521 0.88
费乌瑞它 A 11 31,268 2,213 2,351 0.94
费乌瑞它 B 12 32,262 2,330 2,366 0.98
GS393 A 13 25,424 2,456 2,563 0.96
GS393 B 14 13,147 1,462 1,619 0.90
AV9 A 15 21,671 1,674 1,898 0.87
AV9 B 16 19,242 1,492 1,748 0.85
Yan2 A 17 32,635 2,371 2,359 1.01
Yan2 B 18 34,356 2,482 2,547 0.97
Q304 A 19 20,960 1,623 1,748 0.93
Q304 B 20 8,148 1,169 1,332 0.88
BS226 A 21 30,964 2,417 2,632 0.92
BS226 B 22 25,284 2,160 2,320 0.93
16*7 A 23 16,198 1,442 1,647 0.88
16*7 B 24 23,173 1,975 2,151 0.92
18*8 A 25 13,858 1,429 1,440 0.99
18*8 B 26 17,591 1,676 1,748 0.96
21*15 A 27 17,699 1,540 1,576 0.98
21*15 B 28 24,548 2,115 2,056 1.03
S4 A 29 18,612 1,578 1,581 1.00
S4 B 30 25,524 2,046 1,981 1.03

[0054] 创建potato_out和potato_out9两种格式的输出文件，以potato_out搜索-1的命中程序，若为0则后续分析自动选择以potato_out9进行分析；若不为0则对命中的序列分为1和-1两种情况进行分析。然后利用数据库软件MySQL Selver将potato_match.txt导入数据库命令行my_dbl中，以identity 80%为标准，获得比对效果较好的SNP位点428（土豆EST）+4(水稻EST)。这些位点做为抗寒性状的SNP候选位点。根据EST候选位点总计136个位点，结合文献资料手动选择25个位点进行后续先期功能验证。

[0055] 表3 关联分析筛选位点

[0056] 染色体 编号 位置Chr01 11 78,450,498
Chr01 15 84,216,179
Chr03 30 49,611,841
Chr03 31 49,611,871
Chr04 35 3,141,955
Chr04 42 21,437,925
Chr05 46 11,676,189
Chr05 50 44,218,515
Chr06 55 37,400,620
Chr06 64 54,196,998
Chr06 67 55,019,321
Chr06 70 56,591,685
Chr07 73 2,540,068
Chr07 75 41,318,792
Chr08 82 52,058,615
Chr09 90 55,848,496
Chr10 92 49,592,544
Chr10 97 57,841,645
Chr10 98 57,841,721
Chr10 102 58,454,571
Chr10 103 58,454,613
Chr10 104 58,454,1
Chr10 106 58,466,839
Chr11 114 43,087,410
Chr12 121 8,555,358

[0057]  候选位点克隆与分析

[0058] 根据位点所在位置，选取上下游各500bp，全长1000 bp范围设计引物 ，共计20对。以差异群体材料DNA为模板扩增含目标SNP位点的片段，回收、测序，分析SNP位点情况，最后与材料抗寒性表型进行相关性分析。比对筛选后仅得到与马铃薯抗寒性状相关的位点1个：
该位点由第8对引物克隆测序所得，位于6号染色体37400620位置，碱基为A，将其命名为S-
6-0620。

[0059]  大群体验证

[0060] 为分析获选SNP位点S-6-0620作为抗寒性分子标记的可靠性。提取扩大后的马铃薯资源群体的基因组DNA，PCR克隆，分析马铃薯材料位点S-6-0620所在位置碱基变化情况，再参考该材料的实际抗寒性表型，判断该位点是否为与马铃薯抗寒性状相关的SNP位点。碱基序列比对结果如图所示，图中红色线的碱基即为关注的SNP位点S-6-0620的碱基变化情况，材料群中只有6份材料的碱基在此位点发生了变化，分别为：AV9、GS393、8033（4）、Q304、Yan2。其它材料碱基在该位点与马铃薯参考基因组的碱基一致，均为G。植株抗寒性能表型参考生理测定指标半致死温度。SNP位点S-6-0620变化情况和其植株自身抗寒性比对结果如表1所示。该结果与图1所示结果一致。

[0061] 实施例二

[0062] 试验Ⅰ：（将S60620 SNP位点转化为CAPS标记）

[0063] 待分析马铃薯材料：1、GS393，2、41*8，3、13*10，4、中薯三号，5、8033，6、费乌瑞它。基质盆栽，基质采用商用蔬菜栽培土。

[0064] 采用plant Zol 法提取上述筛选出的抗寒性差异群体材料的基因组DNA。并测定其浓度，凝胶电泳分析见图2。

[0065] 以上述 所提取基因组DNA为模板，应用S60620特异引物F:5’ CTGCAGATG AATGCCGAT 3’ ，R: 5’ CCAGAAATGATCAGGCTG 3’进行PCR扩增，反应体系见表4，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃延伸
10min，电泳分析见图3。

[0066] 表 4 PCR反应体系

[0067] 组成 体积Primer F 2.0ul
Primer R 2.0ul
5×Fast Hifidelity PCR Buffer 10.0ul
Fast Hifidelity Polymerase 0.8ul
DNA 片段 2.0ul
ddH2O 补足50ul

[0068] 以上述 扩增所得产物分别采取BstUI进行酶切，反应体系见表5，温度设定为37℃，消化时间设定为1-2h。酶切结果电泳分析见图4，基于S60620 SNP位点是由G向 A，使得该位点上下400bp左右片段出现新的限制性内切酶位点BstUI，含S60620 SNP位点的耐寒性材料用我们设计的引物扩增片段可以被BstUI切为两条带。

[0069] 表5酶切反应体系

[0070]组成 体积
DNA 1ul
10×Buffer 2ul
BstU 1ul
ddH2O 补足21ul

[0071] 试验Ⅱ：（电导率法求半致死率验证试验Ⅰ的结果）

[0072] 1）取待鉴定的马铃薯材料（含对照1-2份，处理材料数量根据实验室低温处理容量和后续分析能力自行决定）充分成熟的植株上部功能叶片，用蒸馏水反复冲洗并吸干叶片表面水分，将叶片放入50mL离心管中，封口。

[0073] 2）将离心管放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30 min，向离心管中加入一小块冰，保持30 min后取样1。

[0074] 3）温度从0℃降至-1℃，保持1h后取样2。

[0075] 4）温度从-1℃降至-2℃，保持1h后取样3。

[0076] 5）依次类推至温度到-7℃。共取样八次。将取出的所有离心管放在冰上解冻过夜，测量相对电导率。

[0077] 6）取处理后的离心管中的叶片，尽量保持叶片完整性，少含茎节。用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干叶片表面水分，剪成适宜长度的长条，迅速称量三份，每份0.2g,分别置于含20ml去离子水的试管中，封口，室温下浸泡12h后用DDSJ-308A型电导率仪测定提取液电导率（R1），然后沸水浴20min杀死叶片，冷却至室温，充分摇匀后测量浸提液电导率（R2）。相对电导率=R1/R2×100%

[0078] 7）重复测定三次，收集整理数据。

[0079] 8）求半致死率。半致死温度为相对电导率为50%时的数值。通过EXCEL做图，从图上找出相应的点。

[0080] 试验Ⅲ：（霜冻表型分析验证试验Ⅰ的结果）

[0081] -3.5 ℃低温下霜冻处理6小时。寒冻处理：运用人工霜冻箱，-3.5 ℃连续处理6小时，取出室温恢复1小时后进行冻害评估。

[0082] 冻害分级标准：其标准为：0 级，无明显冷害症状；1 级，叶缘略失水， 其他无明显冷害症状；2 级，叶缘失水严重，心叶无明显冷害症状；3 级，叶缘严重失水， 心叶略失水；4 级，叶片萎蔫，心叶严重失水， 很难恢复生长；5 级，全部叶片、茎萎蔫， 幼苗在常温下不能恢复生长。最后用DPS多元统计分析软件进行霜冻评价。

[0083] 结果表明电导率法所得材料的半致死温度越低，材料冻害指数越低，两者呈正相关（表6）。该结果与按本发明分析所得结果高度契合。

[0084] 表6 马铃薯耐低温性半致死率分析

[0085]序号 材料 半致死温度 -3.5℃表型指数
1 GS393 -4.0℃ 0
2 41*8 -1.1℃ 5
3 13*10 -2.3℃ 4
4 中薯三号 -2.3℃ 4
5 8033 -3.4℃ 1
6 费乌瑞它 -2.5℃ 4

[0032] 图1 S-6-0620位点碱基序列比对。

[0033] 图2 待分析马铃薯材料DNA。

[0034] 图3 S60620特异引物PCR反应结果。

[0035] 图4 S60620特异引物扩增产物酶切结果。