实施方案
[0017] 下面通过具体实施例并结合附图,对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0018] 在本发明中,若非特指,所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的,下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域常规方法。
[0019] (1)马鲛鱼蛋白质预处理:取马鲛鱼(Scomberomorus niphonius)提取油脂后的加工副产物,按100g物料加入500mL异丙醇,用组织捣碎机打成匀浆,然后于60oC水浴加热,回流,萃取6h,抽滤,得滤渣,于60oC真空干燥,再粉碎机粉碎,过100目筛,得到脱脂后的马鲛鱼加工副产物蛋白,密封保存,备用;
[0020] (2)酶促水解:以脱脂后的马鲛鱼加工副产物蛋白为原料,按固液比10g:200mL加入20mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液,混匀,于水浴中50oC保温10min。加入占总体积1.0%的碱性蛋白酶(6.0×105U/g),搅拌(150rpm)状态下水解1.5h。将酶促水解液于95oC水浴中加热10min,使酶失活。冷却到温室后,离心(10000rpm,20min,4oC),上清液待等下一步分离;
[0021] (3)铁螯合肽的制备:将上清液过0.45μm滤膜,然后过3KDa超滤膜,收集小于3KDa组分,将此组分依次经(a)亲和层析、(b)离子交换层析、(c)凝胶过滤层析和(d)反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,每一步测定收集峰的铁螯合能力,以铁螯合能力最强的峰进入下一步分离纯化,最后得到铁螯合肽。具体步骤如下:
[0022] (a)亲和层析:使用IMAC Sepharose Fast Flow(IMAC-FF)树脂填充的色谱柱,用于分离铁结合肽。在IMAC-FF(5mL)填充柱中加入10mL 100mM FeCl3溶液。用15mL超纯水将未结合的铁洗出柱之后,再用15mL 50mM pH3.6乙酸钠-乙酸缓冲液除去非特异性结合铁。随后,将2mL超滤后的组分装载到柱上。用平衡缓冲液(50mM pH3.6乙酸钠-乙酸)冲洗约
15mL,然后用15mL 100mM pH4.5 NaH2PO4溶液洗脱,并收集流出液,冷冻干燥;
[0023] (b)离子交换层析:将亲和层析得到的冷冻干燥固体100mg溶于10mL超纯水,并过0.22μm滤膜,上样至DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.6×30cm),进行线性梯度洗脱,120min内由A液(pH7.0 20mM磷酸缓冲液)过滤到B液(pH7.0 20mM磷酸缓冲液,含1M NaCl),设定流速1.0mL/min,进样量为1.0mL,洗脱方法为0-120min线性洗脱,由100% A过渡到100% B。紫外280nm监测,得到五个峰,收集这五个吸收峰的流出液,并以菲洛嗪比色法测定铁螯合能力,第2个峰组分(SPB-2)铁螯合能力最强,达到329μg/g;
[0024] (c)凝胶过滤层析:将离子交换层析得到的SPB2组分上样(1.0mL)到凝胶过滤层析柱(填料为Superdex G75,柱子为1.0×30cm),以超纯水为洗脱液,设定流速1.0mL/min,紫外214m监测,凝胶过滤层析色谱图如图1所示,得到两个峰SPB-2-1和SPB-2-2。收集这两个吸收峰的流出液,并以菲洛嗪比色法测定铁螯合能力,结果如图2所示,第2个峰组分(SPB-2-2)铁螯合能力最强,达到487μg/g。反复多次,制备约50mL SPB-2-2样品液,并冷冻干燥;
[0025] (d)RP-HPLC纯化:将凝胶过滤层析得到的SPB-2-2样品用超纯水配成100ug/mL溶液,利用反相高效液相色谱进行分离,反相色谱柱为C18柱(5μm,4.6 mm×250 mm),进样量20uL,柱温30oC,流速0.8mL/min,流动相A为含0.1%三氟乙酸的5%乙腈,流动相B为含0.1%三氟乙酸的50%乙腈,洗脱梯度为0-5min 100% A流动相,5-60min由100% A线性变化到100% B。检测波长214nm。反相高效液相色谱图如图3所示,按峰收集各组分,共得到a和b两个组分,以菲洛嗪比色法测定铁螯合能力,测得第2个峰组分(b)的铁螯合能力最强,达到824μg/g,组分b即为本发明马鲛鱼蛋白来源的铁螯合肽;
[0026] (4)结构鉴定:对本发明马鲛鱼蛋白来源的铁螯合肽以ESI-MS测定,其分子量为1387.47 Da,用蛋白/多肽序列分析仪测定,其氨基酸序列为Gln-Lys-Gly-Thr-Tyr-Asp-Asp-Tyr-Val-Glu-Gly-Leu(QKGTYDDYVEGL)。
[0027] 一种马鲛鱼蛋白来源的铁螯合肽的应用,将马鲛鱼蛋白来源的铁螯合肽与铁离子溶液螯合,制得铁-肽螯合物,应用于具有补铁功能的食品、药品和保健品中,作为铁补充剂应用。利用马鲛鱼蛋白来源的铁螯合肽具备与铁离子螯合的作用位点,能够形成稳定多肽-铁螯合物,由于其具有独特的螯合机制和转运机制,易被人体吸收,具有安全无毒副作用、促进铁吸收的特点。
[0028] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。