青藤碱4-羟基亚麻酸酯在防治神经退行性疾病中的应用   0    0

[0001] 本发明涉及青藤碱4-羟基亚麻酸酯在防治神经退行性疾病中的应用，尤其涉及一种青藤碱4-羟基亚麻酸酯在防治阿尔茨海默病和帕金森病方面的应用，属于防治神经退行性疾病领域。

[0002] 神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）是大脑和脊髓的神经元丧失的疾病状态，神经炎症（neuroinflammation）是其显著的病变特点，同时也是诱发阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经元退行病变的重要因素（R Medzhitov. Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell, 2010, 140: 771-776）。AD是以进行性认知和记忆功能下降为特征的大脑退行性变性疾病，病变特征主要包括神经炎症斑及神经原纤维缠结。AD患者大脑皮质的神经炎性斑块病灶的周围存在大量的具有活性的小胶质细胞，由此引起的神经炎症反应是AD的重要发病机制（张蓉，等. 中草药，2014，45 (5): 730-737）。帕金森病（PD）导致脑部黑质内多巴胺能神经元的损伤。患病早期给予多巴胺治疗就可以解决这个问题，但会使得患者产生耐药性，早期疗效很快丧失。在PD病理解剖中发现，退行性病变主要区域——黑质中存在大量活化的小胶质细胞。研究表明，神经炎症是诸多神经退行性疾病的共同特征和“公共通路”，而抑制小胶质细胞活化已经成为防治神经退行性疾病的重要策略（杨静玉，等. 以抑制小胶质细胞活化为靶标的抗神经退行性疾病的天然产物及衍生物的筛选与机制研究，世界科学技术—中医药现代化，2011，13(1): 18-24）。

[0003] 青藤碱（sinomenine, Sino）是从防己科植物青藤Sinomenium acutum (Thunb.) Rehd. et Wils.或毛青藤Sinomenium acutum (Thunb.) Rehd. et wils. var. cinereum Rehd. et wils.提取的结构类似于吗啡的生物碱活性成分，具有镇痛、免疫抑制、抗肿瘤以及神经元保护作用等生物活性。为获得高效低毒的青藤碱衍生物，通过结构修饰改造，得到100多个青藤碱衍生物，部分衍生物表现出明显优于青藤碱的抗炎免疫生物活性。但鲜见青藤碱衍生物在抗衰老及防治阿尔茨海默病领域的应用(汤建，等. 青藤碱衍生物的研究进展，天然产物研究与开发，2011，23: 209-213.)。

[0004] α-亚麻酸 (LNA，(9Z, 12Z, 15Z)-9, 12, 15-十八碳三烯酸) 为ω-3多不饱和脂肪酸 (ω-3PUFA)是构成细胞膜和生物酶的基础物质。α-亚麻酸能够激活PPARs，在预防心脑血管疾病、抗炎、抗衰老等方面具有广泛的生物活性和临床应用，（Inger Lauritzen, et al., Polyunsaturated fatty acids are potent neuroprotectors,The EMBO Journal, 2000, 19 (8): 1784–1793）。

[0005] 本发明涉及的化合物是将青藤碱与拼合起来，一方面可以通过改变青藤碱的脂水平衡进而影响青藤碱的吸收、运转和代谢；另一方面，发挥青藤碱和α-亚麻酸分别基于NF-κB和PPARs信号通路的抗神经炎症活性（图5）。

[0006] 本发明的目的在于提供一种青藤碱4-羟基亚麻酸酯（SLN）在防治神经退行性疾病中的应用，旨在增强青藤碱生物利用度、发挥青藤碱和α-亚麻酸基于不同作用机制协同防治阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的药效。

[0007] 其中所述的青藤碱4-羟基亚麻酸酯的结构如下所示：

[0008] 。

[0009] 通过对SLN的药理活性研究，发现SLN具有良好的抗神经炎活性、保护端粒酶作用及抗氧化应激活性。在小胶质细胞BV-2中，SLN显著地抑制NO的释放，并且对细胞的生长具有一定的保护作用；对HEK 293T细胞的端粒酶具有中等强度的激活作用，显示出延长细胞寿命、保护神经细胞、抗衰老的潜力；果蝇实验中SLN能显著增强动物体内过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低脂质过氧化物的降解产物丙二醛（MDA）的含量，抑制体内氧化应激（ROS）效应。因此青藤碱4-羟基亚麻酸酯用于制备防治神经退行性疾病具有良好的治疗潜力。

[0010] 本发明所述的SLN在制备防治AD、PD等神经退行性疾病药物以SLN和/或青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐为活性成分。

[0011] 所述的SLN在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用，可制备成片剂、胶囊、注射用冻干粉针剂等。

[0012] 青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐包括SLN与盐酸、硫酸、柠檬酸、草酸等药学上接受的酸形成的盐。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] 目前对于神经退行性疾病缺乏有效的治疗手段，PD患病早期给予多巴胺可以控制症状，但早期疗效很快丧失。AD患者目前常用的药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物，但只能在一定程度上改善阿尔茨海默病患者的认知功能。基于淀粉样蛋白（Aβ）假说的药物研发也相继遭遇挫折。本发明提供的化合物SLN为前药形式，分别针对NF-κB和PPARs信号通路发挥药效。具有药物制备工艺简单，充分发挥青藤碱和α-亚麻酸基于不同活性机制协同作用、通过前药增强药物靶向性和生物利用度的优势。

[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0021] 实施例1：

[0022] 青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐的制备：将500 mg SLN溶于2 mL甲醇中，冰浴冷却后滴加37%的盐酸 1 mL，持续搅拌15 min，砂芯过滤，得到510 mg 白色蜡状固体。ESI-MS: m/z 590.75 [M+H]+，其质谱图见附图2。

[0023] 实施例2：

[0024] 取上述实施例1制备的青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐或SLN制备成片剂：取4克化合物，加入制备片剂的常规辅料46克，混匀，常规压片机制成 200 片，每片250 mg， 含青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐或SLN 20 mg。

[0025] 实施例3：

[0026] 取上述实施例1制备的青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐或SLN制备成胶囊：取2克化合物，加入制备胶囊剂的常规辅料23克，混匀，常规灌装 100 粒胶囊，每粒250 mg， 含青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐或SLN 20 mg。

[0027] 实施例4：

[0028] 取上述实施例1制备的青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐制备成注射用冻干粉针剂：取2克化合物和4 克甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤，滤液在无菌条件下注入西林瓶中，冻干。每支含10 mg青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐。

[0029] 实施例5：

[0030] 采用BV-2模型评价SLN的抗神经炎症活性：取指数生长期BV-2细胞配制成细胞悬5
浮液接种于24孔板，密度为1×10个/mL，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2孵箱培养24 h，分别加入不同浓度的样品 (20，2.0，0.2 μg/mL) 孵育24 h，再加入LPS (1.0 μg/mL ) 孵育24 h，离心，收集上清，与Griess试剂反应15 min后，于酶标仪490 nm处检测每孔的OD值，参照回归方程y = 0.017x +0.0497（r2=0.9996）计算NO浓度。

[0031] 结果：SLN对小胶质细胞BV-2释放NO能力有显著的抑制作用，2.0 μg/mL浓度抑制率达51.3%， IC50 为1.17 μg/mL，低于对照药物青藤碱的2.47 μg/mL。如附图3，电镜下可以观察到LPS刺激的BV-2细胞出现明显的阿米巴样，处于激活状态，给予药物处理后，其激活状态受到明显抑制。

[0032] 实施例6：

[0033] 采用TRAP实验评价SLN对端粒酶活性的影响：HEK 293T细胞接种于12孔板中，置于37 ℃，5% CO2孵箱培养48 h，加入SLN，浓度为0.01，0.1，1.0，10 μM，空白组为0.1% DMSO，复孔。 继续孵育48 h后收集细胞。离心除去培养液，加入PBS洗涤，Chaps消化，离心，取上清液，参照TRAPEZE®端粒酶试剂盒操作说明，测定SLN对端粒酶的活性。

[0034] 结果：SLN对端粒酶具有温和的激活作用，在0.01，0.1，1.0，10 μM浓度下，端粒酶活性分别增加1.0%，27.7%，42.8%和36.9%（图4B），且作用强度高于青藤碱。说明SLN具有基于端粒酶机制的抗神经细胞衰老和防治神经退行性疾病的潜力。

[0035] 实施例7：

[0036] 采用果蝇实验评价SLN对氧化应激效应的影响：琼脂粉6 g、玉米粉72 g、无水葡萄糖72 g、酵母粉10 g、防腐剂（1%对羟基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），配成基础培养基；在基础培养基中分别添加浓度为30 mg/L和10 mg/L的SLN。

[0037] 果蝇寿命实验：收集48 h羽化黑腹果蝇成虫，随机分组，每组果蝇400只，雌雄各半。每96 h更换新鲜培养基。实验开始后，每天定点观察，记录果蝇死亡数，直到各组果蝇全部死亡为止。计算果蝇的半数死亡时间、最高寿命、平均寿命和平均延寿率，其中平均延寿率(% )= (给药组平均寿命-对照组平均寿命) /对照组平均寿命×100%。实验数据见表1，说明SLN具有良好的延长果蝇寿命的作用。

[0038] 表1. SLN对果蝇寿命的影响

[0039]

[0040] **与对照组比较，p<0.01, *与对照组比较，p<0.05

[0041] CAT、 SOD 和MDA的测定：收集48 h羽化黑腹果蝇成虫，随机分组试验。每组果蝇200只，雌雄各半。每96 h更换新鲜培养基。在给药后第30天时，用生理盐水制成8%的组织匀浆；以4000 rpm 离心10 min，按照CAT、 SOD 和MDA试剂盒说明分别测定每组上清液CAT、SOD及MDA水平，实验数据见表2。

[0042] 表2. SLN对果蝇中CAT、SOD及MDA的影响

[0043]

[0044] **为与对照组比较，p<0.01；*为与对照组比较，p<0.05。

[0045] 由表1和2可见，SLN可以延长果蝇寿命，可以提高果蝇体内CAT和SOD的水平，降低脂质过氧化物的降解产物MDA的含量，表明SLN有较好的抗ROS能力。

[0046] 以上实验结果说明SLN具有良好的抗神经炎症、活化端粒酶和抗体内氧化应激能力，在治疗神经退行性疾病方面具有良好的应用潜力。

[0015] 图1为SLN的制备路线图，详细操作参见文献（张蓉，青藤碱4-羟基酯化衍生物的制备及抗神经炎症活性的初步研究，江苏大学硕士论文，2014.6）。该化合物的1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, H-2), 6.76 (1H, d, J=8.4 Hz, H-1), 5.50 (1H, d, J= 1.2 Hz, H-8), 5.23- 5.32 (6H, m, H-9′, 10′, 12′, 13′, 15′, 16′), 3.78 (1H, m, H-5a), 3.65 (3H, s, 3-OCH3), 3.40 (3H, s, 7-OCH3), 3.00-3.20 (3H, m, H-9, H-10a, H-14), 2.70-2.75 (7H, m, N-CH3, 2×H-11′, 2×H-14′ ), 2.40-
2.60 (3H, m, H-5b, H-10b, H-16a, H-2a′), 2.15-2.25 (1H, m, H-2b′), 1.94-2.02 (4H, m, 2×H-8′, 2×H-17′), 1.66-1.70 (3H, m, 2×H-15, H-16b), 1.19-1.34 (10H, m, (CH2)5), 0.89 (3H, t, J= 7.6 Hz, 18′-CH3)。

[0016] 图2 为青藤碱4-羟基亚麻酸酯盐酸盐质谱图。

[0017] 图3为SLN作用于BV-2细胞的形态图。

[0018] 图4为SLN对HEK293T细胞端粒的影响图；图4A为SLN的TRAP图；图4B 为SLN对端粒酶活性图。

[0019] 图5为青藤碱4-羟基亚麻酸酯设计图。