一种使用乙酰丁香酮提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法及应用   0    0

[0001] 本发明涉及环境污染技术处理领域，特别是涉及一种使用乙酰丁香酮提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法及应用。

[0002] 己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是一种合成的非甾体雌激素或异雌激素，具有比雌二醇更强的雌激素活性(Korach et al.，1978；Shang et al.，2014)。自1938年被英国化学家合成后，最初用于治疗肠胃不适、头晕和皮肤红肿。后来被作为预防流产的处方药而广泛应用于医学界，还被用于治疗晚期前列腺癌、乳腺癌、卵巢功能不全、闭经、子宫发育不全、功能性子宫出血等疾病(Goyal et al.，2001；Grenader et al.，2014；Koong et al.，2014)。在1971年己烯雌酚因被发现可诱发多种女性疾病而遭禁用(He et al.，2002；Tournaire et al.，2015.，2018；Troisi et al.，2016)。但是己烯雌酚作为外敷、或者是临床手术辅助药物及动物的生长促进剂依然被广泛应用于临床和畜禽生产中，其中一部分DES或DES代谢产物随着动物的粪便、尿等进入环境。进入环境中的DES虽然一般浓度较低，甚至是微量的，但在生态系统中，可以通过生物浓缩、生物积累和生物放大三种途径增大浓度，然后进入食物链，同样危害生物体和人类的健康。

[0003] 目前，关于降解DES的报道较少，因此需要一种降解DES的方法。林等人利用臭氧氧化降解DES，但效果却不显著(Lin et al.，2009)。徐等人研究了己烯雌酚的紫外光转换及其在阳光下对地表水的持久性污染，发现DES能够被光催化降解，但也发现DES是一种光致变色化合物，其紫外诱导的中间体可以在阳光下转化回DES，这显然减缓了DES的光降解(Xu et al.，2017)。作为一类脂溶性化合物DES在环境中不易被降解。传统的处理方法来降解这类酚类有机污染物不仅费用昂贵且效果不佳(Snyder et al.，2003；Tay et al.，2009)。

[0004] 漆酶是一种典型的生物催化剂，是一种含铜的多酚氧化酶，其催化有机底物的单电子后，同时将其中的氧分子还原成水。已有研究表明漆酶由于其低氧化还原电位可以催化多种酚类化合物，并且通过加入介质能够扩展其催化底物范围以及提高氧化效率(Ashe et al.，2016；Kurniawati et al.，2007；Parra et al.，2019)。但是，漆酶在催化降解过程中，仍存在降解效率低的问题，因此，选取合适的介质来提高漆酶的降解效率已经成为环境处理中的热点问题。

[0005] 本发明的目的是提供一种使用乙酰丁香酮来提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法，以解决上述现有技术存在的问题，使己烯雌酚能够达到高效降解。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种使用乙酰丁香酮提高漆酶降解己烯雌酚降解率的方法，具体步骤如下：

[0008] (1)将己烯雌酚溶于甲醇中形成己烯雌酚溶液，分别将漆酶和乙酰丁香酮溶于醋酸‑醋酸钠缓冲溶液中形成漆酶溶液和乙酰丁香酮溶液；

[0009] (2)将步骤(1)中的漆酶溶液和乙酰丁香酮溶液混合形成漆酶‑乙酰丁香酮介质缓冲溶液，与己烯雌酚溶液混合，放入震荡培养箱中反应；

[0010] (3)用乙酸乙酯将反应淬灭，完成降解。

[0011] 进一步地，所述醋酸‑醋酸钠缓冲溶液的pH为5.5，浓度为0.01mol/L；

[0012] 进一步地，所述漆酶为彩绒革盖菌所产，酶活为0.94U/mg；

[0013] 进一步地，所述漆酶溶液浓度为1mg/mL；

[0014] 进一步地，所述己烯雌酚母液浓度为2.5g/L；

[0015] 进一步地，所述乙酰丁香酮浓度为0.01mol/L；

[0016] 本发明还提供一种检测己烯雌酚降解率的方法，具体为：

[0017] 将己烯雌酚溶液分别稀释成浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的标准液，利用HPLC检测峰面积制作己烯雌酚标准曲线，待降解反应结束后，利用HPLC检测剩余己烯雌酚的浓度，计算降解率。

[0018] 进一步地，HPLC检测所用高效液相色谱仪为安捷伦A1260高效液相色谱仪；所用色谱柱为ZORBAX SB‑C18(150mm×4.6mm×5μm)；

[0019] 进一步地，HPLC检测条件为；进样体积10‑30μL，以等体积的乙腈和水为流动相等梯度洗脱10‑20min，泵流速为1.0‑2.5mL/min，柱温：30‑35℃，紫外检测器检测240nm波长处的出峰情况，记录峰面积值；

[0020] 进一步地，降解率计算公式为：降解率＝(C0‑C)/C0×100％，其中C0是初始浓度，C是最终浓度。

[0021] 本发明还提供一种乙酰丁香酮提高漆酶降解己烯雌酚降解率的应用。

[0022] 本发明公开了以下技术效果：

[0023] 在漆酶催化降解已烯雌酚的过程中，由于已烯雌酚可能存在的空间位阻影响，使得已烯雌酚在与漆酶进行结合时不能完全进入漆酶的肽链空腔，而是依附在其空腔凹槽中，这种空间位阻效应导致了漆酶在催化降解已烯雌酚的过程中存在降解效率低的问题。本发明利用乙酰丁香酮作为氧化还原介质，使其作为催化降解过程中漆酶和底物之间的电子穿梭介质，使得介质可以通过与酶活性位点或蛋白质结构上的其他合适区域进行结合从而产生比漆酶本身对底物具有更高氧化能力的自由基物质，进而克服漆酶的空间位阻和动力学限制，使漆酶能够更好地实现与己烯雌酚结合，显著提高漆酶的降解效率。同时，本发明的操作方法简单、高效，在环境污染处理中具有极高的应用价值。

[0027] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0028] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0029] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0030] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0031] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0032] 实施例1绘制己烯雌酚标准曲线

[0033] 将浓度为2.5g/L的己烯雌酚母液进行稀释，分别得到浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的己烯雌酚标准溶液，利用HPLC检测法绘制己烯雌酚标准曲线，如图1所示。

[0034] 实施例2

[0035] (1)将0.5ml的1mg/mL的漆酶溶液、0ml的0.01mol/L的乙酰丁香酮溶液和0.4ml的2.5g/L的己烯雌酚标准液混合，用醋酸‑醋酸钠缓冲溶液定容至10ml，放入55℃振荡培养箱中反应；

[0036] (2)反应0.5h后，用乙酸乙酯将反应液萃取两次，将有机相提取后旋蒸至尽干，加入甲醇定容，利用真空过滤膜取样；

[0037] (3)通过HPLC检测法对反应后的样品进行浓度测量，根据公式，降解率＝(C0‑C)/C0×100％，计算已烯雌酚降解率为44.56％。

[0038] 实施例3

[0039] (1)将0.5ml的1mg/mL的漆酶溶液、0.1ml的0.01mol/L的乙酰丁香酮溶液和0.4ml的2.5g/L的己烯雌酚标准液混合，用醋酸‑醋酸钠缓冲溶液定容至10ml，放入55℃振荡培养箱中反应；

[0040] (2)反应0.5h后，用乙酸乙酯将反应液萃取两次，将有机相提取后旋蒸至尽干，加入甲醇定容，利用真空过滤膜取样；

[0041] (3)通过HPLC检测法对反应后的样品进行浓度测量，根据公式，降解率＝(C0‑C)/C0×100％，计算已烯雌酚降解率为83.62％。

[0042] 实施例4

[0043] (1)将0.5ml的1mg/mL的漆酶溶液、0.3ml的0.01mol/L的乙酰丁香酮溶液和0.4ml的2.5g/L的己烯雌酚标准液混合，用醋酸‑醋酸钠缓冲溶液定容至10ml，放入55℃振荡培养箱中反应；

[0044] (2)反应0.5h后，用乙酸乙酯将反应液萃取两次，将有机相提取后旋蒸至尽干，加入甲醇定容，利用真空过滤膜取样；

[0045] (3)通过HPLC检测法对反应后的样品进行浓度测量，根据公式，降解率＝(C0‑C)/C0×100％，计算已烯雌酚降解率为89.85％。

[0046] 实施例5

[0047] (1)将0.5ml的1mg/mL的漆酶溶液、0.6ml的0.01mol/L的乙酰丁香酮溶液和0.4ml的2.5g/L的己烯雌酚标准液混合，用醋酸‑醋酸钠缓冲溶液定容至10ml，放入55℃振荡培养箱中反应；

[0048] (2)反应0.5h后，用乙酸乙酯将反应液萃取两次，将有机相提取后旋蒸至尽干，加入甲醇定容，利用真空过滤膜取样；

[0049] (3)通过HPLC检测法对反应后的样品进行浓度测量，根据公式，降解率＝(C0‑C)/C0×100％，计算已烯雌酚降解率为94.15％。

[0050] 实施例6

[0051] (1)将0.5ml的1mg/mL的漆酶溶液、1ml的0.01mol/L的乙酰丁香酮溶液和0.4ml的2.5g/L的己烯雌酚标准液混合，用醋酸‑醋酸钠缓冲溶液定容至10ml，放入55℃振荡培养箱中反应；

[0052] (2)反应0.5h后，用乙酸乙酯将反应液萃取两次，将有机相提取后旋蒸至尽干，加入甲醇定容，利用真空过滤膜取样；

[0053] (3)通过HPLC检测法对反应后的样品进行浓度测量，根据公式，降解率＝(C0‑C)/C0×100％，计算已烯雌酚降解率为93.88％。

[0054] 图2为实施例2‑6己烯雌酚溶液随乙酰丁香酮浓度变化的降解率曲线。

[0055] 由图2可以看出，随着乙酰丁香酮加入量的增加，漆酶对于己烯雌酚的降解效果提高，当乙酰丁香酮浓度达到0.6mM/L时，漆酶对于己烯雌酚的降解率达到最高，为94.15％，之后随着乙酰丁香酮浓度的升高，漆酶对于己烯雌酚的降解率呈下降趋势。

[0056] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0025] 图1为己烯雌酚溶液标准曲线；

[0026] 图2为实施例2‑6己烯雌酚溶液随乙酰丁香酮浓度变化的降解率曲线。