[0050] 弗氏完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。罗丹明异硫氰酸酯标记的3‑氨丙基三乙氧基硅烷购买于合肥拜尔迪，其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
[0051] 本发明涉及到的各溶液的制备方法为：
[0052] PBS溶液(0.01mol/L pH＝7.4)：称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H2O 0.106g、Na2HPO4·12H2O 3.34g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
[0053] 碳酸盐缓冲液CD(0.5mol/L pH＝9.6)：称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至100mL。
[0054] PBST溶液(0.01mol/L pH＝7.4)：在1000mL PBS中加入500μL Tween‑20，混合均匀。
[0055] 包被缓冲液fe(0.05mol/L pH＝9.6)：称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
[0056] 醋酸缓冲液：称取84.25g醋酸钠，用水溶解，加入100ml醋酸，用水稀释至2500ml即得到(PH＝4.2)醋酸醋酸钠缓冲溶液。
[0057] 1wt％酪蛋白溶液：其为封闭液，称取0.01g酪蛋白溶解于1mL PBS中，混合均匀。
[0058] 实施例1
[0059] 一种基于磁性荧光探针标记的荧光免疫吸附测定超痕量高分子纳米药物载体的方法，包括以下步骤：
[0060] a、制备PSIOAm水解溶液:
[0061] 将20～60mg的PSIOAm溶解到1～5mL三氯甲烷溶液中，溶解后将上述溶液加入到10～16mL浓度为0.001～0.008mg/mL的氢氧化钠溶液中，超声10～30min，功率300～600W，然后磁力搅拌20～50min，将溶液于40～60℃下蒸发除去三氯甲烷，于12000～20000r/min离心10～15min，用pH＝7.4的PBS洗涤3次，取沉淀分散在0.5～2mL pH＝7.4的PBS缓冲液中，‑得到水解后的PSIOAm‑COO溶液。
[0062] b、制备PSIOAm包被抗原和免疫原:
[0063] b‑1、将1mgOVA溶于1mLPBS溶液中，然后加入步骤a水解后的PSIOAm‑COO‑溶液1mL，最后加入1mLPBS缓冲溶液，该缓冲液中包含0.1～1mg的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.1～1mg的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，混旋反应10～30min，静置30～
60min后离心分离，用pH＝7.4的PBS洗涤3次，然后加入1～10mg牛血清白蛋白，于25℃下温育2～4h，之后于离心机12000～20000r/min离心10～15min，取沉淀分散到1mLPBS(pH＝
7.4)缓冲液中，将溶液装入透析袋中，放入PBS缓冲溶液中透析12小时以上，即可制得PSIOAm‑OVA的包被抗原；
[0064] b‑2、向水解后的PSIOAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和牛血清白蛋白，20‑30℃温育3～6h后，离心分离，取沉淀分散于pH＝7.4的PBS缓冲液中即得到PSIOAm免疫原溶液；
[0065] 所述步骤b‑1中透析袋的截留分子量为8000～25000Da；
[0066] c、抗PSIOAm抗体的制备:
[0067] c‑1、首次免疫：将PSIOAm免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；
[0068] c‑2、加强免疫：将PSIOAm免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；此后每两周进行再次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗PSIOAm抗体。
[0069] d、磁性荧光探针的制备:
[0070] d‑1、首先将10.8g的FeCl3·6H2O和36.5g的油酸钠溶于80mL乙醇中，依次加入60mL去离子水和140mL环己烷，70℃加热4h。待冷却到室温时，有机层用去离子水萃取3次，萃取的溶液混合，在70℃下加热4h蒸发掉环己烷,冷却至室温时出现红褐色的粘稠状的物质，即成功的合成了油酸铁；
[0071] d‑2、将9g步骤d‑1制备的油酸铁加入到50g的十八碳烯中，搅拌均匀后再加入1.4g的油酸，混合溶液加热到100℃保持30min后抽真空，混合物在氮气氛围下加热到320℃保持3h,待反应将到室温时加入20mL无水乙醇使铁纳米晶沉淀，反复洗涤3次后晾干，即得四氧化三铁纳米晶，备用；
[0072] d‑3、将步骤d‑2制备四氧化三铁纳米晶用环己烷溶解，得100mg/mL四氧化三铁纳米晶溶液，分别取14.4mL环己烷、3.3mL TX‑100、0.5mL CO‑520、3.3mL正己醇、1.5mL去离子水、0.25mL氨水于100mL烧杯中搅拌均匀，随后加入1mL 100mg/mL的四氧化三铁纳米晶溶液，再加入50μL的硅酸四乙酯搅拌2小时，反应完之后离心，用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥，即得二氧化硅功能化的四氧化三铁纳米晶，备用；
[0073] d‑4、准确称取6.7mg的d‑3中制备的样品分散于50mL的去离子水中，用2M的氢氧化钠调节溶液的pH＝9.0，将体系加热到70℃，依次加入0.5mL的硅酸四乙酯，0.05mL的罗丹明异硫氰酸酯标记的3‑氨丙基三乙氧基硅烷，3mL的乙酸乙酯，避光搅拌10min后，加入0.05mL的3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌3h，冷却至室温后乙醇洗涤3次，冷冻干燥，即得磁性荧光探针，备用。
[0074] e、磁性荧光探针标记的抗PSIOAm抗体的制备:
[0075] e‑1、取纯化后的抗PSIOAm抗体0.4mg加入0.07mL的醋酸缓冲液(0.05mol/L，pH＝4.2)之后加入0.14mL的过碘酸钠溶液(1.5mg/mL，pH＝4.2)避光搅拌2h；
[0076] e‑2、取2mg多功能磁性荧光探针用PBS洗3次，充分悬浮于0.6mL的PBS中，缓慢加入氧化后的抗体，4℃下搅拌20h；加入0.02mL 2mg/mL的硼氢化钠溶液,避光反应2h，用PBS洗涤3次后备用。
[0077] f、将PSIOdm包被抗原经包被液稀释后包被于96孔板中，封闭、加入不同浓度的PSIOAm标准品，用功能化磁性荧光探针标记抗PSIOAm抗体，建立直接竞争荧光免疫吸附测定PSIOAm:
[0078] f‑1、包被：用0.05M，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释将PSIOAm包被抗原溶液稀释到25μg/mL，包被于96孔板中，每孔100μL，冰箱4℃过夜；
[0079] f‑2、封闭：取出96孔板，PBST洗涤3次，每次3min，洗去未结合的PSIOAm包被抗原,加入1wt％酪蛋白进行封闭，每孔200μL，37℃封闭1.5h；
[0080] f‑3、加样竞争：PBST洗涤3次，甩干，每次3min，将50μL浓度分别为5×10‑5ng/mL、1‑4 ‑4 ‑3 ‑3 ‑2 ‑2 ‑1×10 ng/mL、5×10 ng/mL、10 ng/mL、5×10 ng/mL、10 ng/mL、5×10 ng/mL、10 ng/mL、
2 2 3
0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、1×10ng/mL、5×10ng/mL、10ng/mL的PSIOAm标准液依次加入到96孔板的各行中，即每个浓度梯度重复三次，然后向各孔中加入50μL功能化磁性荧光探针标记的抗PSIOAm抗体，37℃竞争1.5h；
[0081] f‑4、之后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟，甩干；不同浓度的PSIOAm标准液的制备方法为：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液将PSIOAm稀释到规定的标准浓度；在酶标仪上测定各孔在激发波长为530nm，发射波长为585nm时的荧光强度。
[0082] 将PSIOAm包被抗原经包被液稀释后包被于96孔板中，封闭、加入不同浓度的PSIOAm标准品，以功能化磁性荧光探针标记的PSIOAm抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析定量检测PSIOAm。利用功能化磁性荧光探针标记的PSIOAm抗体和PSIOdm包被抗原进行直接竞争荧光免疫分析法，由于直接竞争荧光免疫分析法是利用抗PSIOAm抗体与PSIOAm包被抗原特异性结合，通过检测抗原抗体的复合物的荧光信号达到定量检测抗原的目的，该方法比直接竞争酶联免疫法的光信号检测抗原具有更低的检出限，更高的灵敏度。
[0083] g、以PSIOAm标准液浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标建立标准曲线，制得的标准曲线如图1所示，标准曲线的线性方程为：F＝11477.59‑1537.63lgC，其中F为荧光强2 ‑5 3
度值，f为PSIOAm的浓度，其相关系数R ＝0.994，线性范围为5×10 ‑1×10ng/mL，检出限为‑7
3×10 ng/mL。
[0084] 重复以上各步骤，只是将步骤f‑3中的不同浓度的PSIOAm标准液替换为未知浓度的PSIOAm待测液，然后在在酶标仪上测定各孔在激发波长为530nm，发射波长为585nm时的荧光强度，求取平均荧光强度值，根据上述标准曲线即可计算出PSIOAm待测液的浓度。
[0085] 以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法，此方法所得到的标准曲线的线性关系最好，线性范围最宽。
[0086] 上述参照实施例对基于功能化磁性荧光探针标记的荧光免疫吸附法定量检测油胺接枝聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
