[0035] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0036] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0037] 本发明提供了一种以金属丝为模板的硅胶整体开管毛细管柱的制备方法，该制备方法包括：
[0038] 1)将金属丝引入第一毛细管中作为模板，接着将溶胶溶液灌装至毛细管中，然后将第一毛细管的两端进行封端；
[0039] 2)将毛细管进行热处理，再进行程序升温处理，接着将模板脱除，然后依次对第一毛细管进行清洗、干燥和煅烧，以制得硅胶整体开管毛细管柱；
[0040] 其中，溶胶溶液包括聚乙二醇、尿素、正硅酸甲酯、醋酸溶液。
[0041] 在上述制备方法中，溶胶溶液中各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步优化整体开管毛细管柱的固定相的收缩率、机械强度和多孔性，优选地，在溶胶溶液中，聚乙二醇、尿素、正硅酸甲酯、醋酸溶液的用量比为0.104‑0.144g：0.08‑0.10g：300‑500μL：0.8‑1.5mL；更优选为 0.122‑0.126g：0.08‑0.10g：350‑450μL：0.8‑1.5mL。
[0042] 在上述制备方法中，溶胶溶液的制备方法可以在宽的范围内选择，但是为了进一步优化整体开管毛细管柱的固定相的收缩率、机械强度和多孔性，同时为了规避溶胶溶液发生凝胶化；优选地，溶胶溶液的制备包括以下步骤：将聚乙二醇、尿素、醋酸溶液于冰浴条件下搅拌8‑10min，接着加入正硅酸甲酯冰搅拌30‑50min，然后于冰浴、40‑60KHz的超声条件下震荡8‑10min。
[0043] 在本发明中，聚乙二醇的种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步优化整体开管毛细管柱的固定相的收缩率、机械强度和多孔性，优选地，聚乙二醇选自PEG‑400、PEG‑2000、PEG‑4000、PEG‑10000和PEG‑20000中的至少一种；更优选地，聚乙二醇选自PEG‑
10000。
[0044] 在本发明中，醋酸溶液的pH可以在宽的范围内选择，但是为了进一步优化整体开管毛细管柱的固定相的收缩率、机械强度和多孔性，醋酸溶液的 pH为1‑5；更优选地，醋酸溶液的pH为3‑4。
[0045] 在本发明中，为了保证第一毛细管的两端完全封闭，优选地，封端采用将封端物滴加在第一毛细管的两端；优选地，封端物为硅橡胶；优选地，第一毛细管的两端的封端物的用量为1‑2滴(滴加时硅橡胶为半固态状态)。
[0046] 此外，为了防止溶胶溶液发生凝胶化或收到污染，优选地，金属丝自引入至第一毛细管中到封端过程中温度为0‑25℃，时间控制在30min以内。
[0047] 在本发明中，为了保证金属丝4处于第一毛细管3的中间位置，优选地，如图12步骤e所示，在封端之前，步骤1)还包括对金属丝的定位，金属丝 4的两端位于第一毛细管3的外部；第二毛细管2的为漏斗形；所述定位包括：将所述金属丝4的一端自所述第二毛细管2的宽口端5引入至所述窄口端6内，以使得所述金属丝4的一端固定于所述窄口端6内，同时，所述宽口端5套设于所述第一毛细管3的一端的外部。
[0048] 此外，第二毛细管的加工方式也可以在宽的范围内选择，但是为了从加工的难以程度上考虑，其中，如图12的步骤a‑d所示，第二毛细管的加工方式为：将毛细管原始管1竖直放置，下端套上20μL的移液枪头(给毛细管原始管1竖直向下的拉力，中间部位受热软化后自然下拉，导致中间变细)，在毛细管原始管1的中部进行灼烧，玻璃受热软化自然下拉。被灼烧的点样毛细管内径逐渐减小，在金属细丝4无法穿入的地方用毛细管切割器切断，备用。
[0049] 在本发明中，第一毛细管、第二毛细管的种类可以在宽的范围内选择，但是从操作的便捷性以及强度上考虑，优选地，所述第一毛细管为色谱柱毛细管，所述第二毛细管为点样毛细管。
[0050] 在本发明中，第一毛细管、第二毛细管的尺寸可以在宽的范围内选择，但是为了便于金属丝4的固定，优选地，所述第一毛细管的外径为 355‑375μm，所述宽口端的最大内径比所述第一毛细管的外径大5‑10μm；优选地，窄口端的最窄处的内径比金属丝的直径大2‑5μm。
[0051] 此外，在上述制备方法中，为了便于调控固定相的厚度，优选地，第一毛细管的内径为55‑75μm；更优选地，金属丝的直径为25‑50μm。更进一步优选地，模板的直径为50μm，第一毛细管的内径为75μm。
[0052] 在本发明中，金属丝的种类也可以在宽的范围内选择，但是便于操作；优选地，金属丝选自金丝和铂丝中的一者。
[0053] 在上述制备方法的步骤2)中，凝胶化反应的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高固定相的机械强度和均匀性，优选地，在步骤2)中，热处理至少满足以下条件：温度为30‑50℃，时间为11‑16h；更优选地，热处理于水浴中进行。
[0054] 在本发明中，程序升温的过程可以在宽的范围内调整，但是为了在较短时间内获得均匀的固定相，优选地，在步骤2)中，升温处理满足以下条件：自50℃以15‑25℃/h的速率升温至110‑130℃，并保温2.5‑3.5h；
[0055] 在本发明中，清洗的方式可以在宽的范围内调整，但是为了使柱内洁净且干燥，优选地，清洗包括：依次使用高纯水、甲醇清洗2‑3次。
[0056] 在本发明中，干燥的条件可以在宽的范围内调整，但是为了使柱内洁净且干燥，优选地，在步骤2)中，干燥至少满足以下条件：温度为50‑70℃，时间为6‑8h。
[0057] 在本发明中，煅烧的条件可以在宽的范围内调整，但是为了提高固定相的机械强度和多孔性，优选地，煅烧至少满足以下条件：温度为320‑380℃，时间为4‑6h。
[0058] 在本发明中，模板脱除的方式可以在宽的范围内选择，但是为了使固定相形貌较好，优选地，模板脱除包括：将第一毛细管的一端完全切断，另一端进行环切且不切断金属丝；然后自环切的一端向外抽拉以使得模板脱除出第一毛细管。
[0059] 在本发明中，模板脱除的时机可以在宽的范围内选择，但是为了使固定相形貌较好，优选地，模板脱除于第一毛细管冷却后进行。
[0060] 在本发明中，为了使制得的固定相能有更高的洁净度、更好的稳定性和耐久性，优选地，在步骤1)之前，该制备方法还包括：将金属丝于高纯水和乙醇中分别超声8‑10min，然后干燥；将第一毛细管依次通过浓度为 1‑2mol/L的氢氧化钠溶液、浓度为0.1‑0.2mol/L的盐酸溶液、高纯水和丙酮于50‑60℃下冲洗4‑6h；通过上述预处理的手段能够使得毛细管内壁能够暴露出足够多的的硅羟基与固定相反应。
[0061] 在本发明中，为了防止溶胶溶液存在大颗粒物质，优选地，在溶胶溶液进行灌装时，溶胶溶液通过0.45μm针头式过滤器过滤。
[0062] 本发明提供了一种以金属丝为模板的硅胶整体开管毛细管柱，该以金属丝为模板的硅胶整体开管毛细管柱通过上述制备方法制备而得。
[0063] 以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，SEM扫描图通过日本日立公司扫描电子显微镜(S8100)拍摄所得；氮吸附‑脱附曲线可孔径分布通过美国麦克仪器公司的氮吸附‑解吸测试仪(ASAP‑2460)测得。
[0064] 药品：正硅酸四乙酯为Demas‑beta牌号为分析纯市售品；聚乙二醇为国药集团试剂有限公司牌号为分析纯；尿素为国药集团试剂有限公司牌号为分析纯；冰醋酸为国药集团试剂有限公司牌号为分析纯。
[0065] 金属丝的定位操作为：金属丝4的两端位于色谱柱毛细管的外部；第二毛细管2的为漏斗形；将所述金属丝4的一端自所述第二毛细管2的宽口端 5引入至所述窄口端6内，以使得所述金属丝4的一端固定于所述窄口端6 内，同时，所述宽口端5套设于色谱柱毛细管的一端的外部。
[0066] 模板脱除操作为：将色谱柱毛细管的一端完全切断，另一端进行环切且不切断金属丝；然后自环切的一端向外抽拉以使得模板脱除出色谱柱毛细管。
[0067] 制备例1
[0068] 如图12的a‑d所示，将各种规格的点样毛细管竖直放置，下端套上20μL 的移液枪头，在点样毛细管的中部进行灼烧，玻璃受热软化自然下拉。被灼烧的点样毛细管内径逐渐减小，在金属细丝4无法穿入的地方用毛细管切割器切断，形成各种规格的第二毛细管。
[0069] 实施例1
[0070] 1)将0.124g PEG‑10000和0.09g尿素溶于1mL醋酸溶液(pH为3.4) 中，冰水浴下搅拌十分钟后，向其中加入400μL正硅酸甲酯TMOS，冰水浴下搅拌40min，保持冰水浴冰浴、50KHz的超声条件下震荡10min除气。
[0071] 将金属丝于高纯水和乙醇中分别超声8‑10min，然后干燥。
[0072] 将色谱柱毛细管依次通过浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液、浓度为 0.1mol/L的盐酸溶液、高纯水和丙酮于60℃下冲洗5h。
[0073] 2)将上述溶胶溶液用0.45μm针头式滤器过滤，灌装入穿有模板金丝(直径为50μm)的色谱柱毛细管(内径为75μm，外径为365μm)中。
[0074] 对模板进行定位(定位中的第二毛细管宽口端的最大直径为370μm，窄口端的最小直径为53μm)后，进行封端(色谱柱毛细管的两端分别滴加1 滴硅橡胶)，置于40℃水浴锅中反应14h；
[0075] 3)将上述色谱柱毛细管柱置于烘箱中进行程序升温(自50℃以20℃/h 的速率升温至120℃，并保温3h)，待色谱柱毛细管柱冷却至25℃，将色谱柱毛细管柱的两端切口并将模板抽出，分别用水和甲醇冲洗色谱柱毛细管柱后，将色谱柱毛细管柱置于60℃烘箱中干燥7h。最后，将色谱柱毛细管柱置于马弗炉中350℃煅烧5h，制得硅胶整体开管毛细管柱。
[0076] 该实施例的硅胶整体开管毛细管柱的扫描电镜图见图1中的c和d(固定相的厚度大约为8.5μm)。
[0077] 实施例2
[0078] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，将色谱柱毛细管依次用氢氧化钠溶液、盐酸溶液、高纯水和丙酮在25℃下进行冲洗5h。
[0079] 该实施例的硅胶整体开管毛细管柱的扫描电镜图见图1中的a和b(图中，固定相受到破坏，无法测量固定相厚度)。
[0080] 在图1中，室温(25℃)处理的毛细管中硅整体材料不能有效的键合在毛细管壁上。分析是由于当柱子置于烘箱内程序升温后，固定相发生一定收缩，由于与毛细管壁键合不够紧密就会发生向内收缩，包裹于模板上，使得模板抽出时将固定相也带出了。而实施例1中60℃预处理的毛细管，内壁则暴露出了足够的硅羟基，使固定相与管壁形成(Si‑O‑Si)结构。当固定相发生收缩时，其与毛细管壁紧密键合就会导致向管壁收缩，从而与模板产生一定的距离，当模板抽出时，固定相依然牢固的附着在毛细管内壁上。
[0081] 实施例3
[0082] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，不同的是模板脱除的时机依次分别为：于40℃水浴锅中反应40min后、于40℃水浴锅中反应14h后和煅烧结束后，具体结果见图2。
[0083] 其中，图2中的a和b对应的是于40℃水浴锅中反应40min后脱除模板；c和d对应的是于40℃水浴锅中反应14h后脱除模板；e和f对应的是于烘箱程序升温后脱除模板(即为实施例1的产物)；g和h对应的是煅烧结束后脱除模板。
[0084] 在图2中，a中固定相分布不均，未呈现规整的固定相形貌，可能是因为水浴40min后还未完全凝胶化导致。c中固定相收缩过度导致开裂，推测可能是由于模板抽出后中间留有孔道，当在烘箱中升温时，溶剂过快挥发所致。而g中固定相也受到一定程度的破坏，可能是由于煅烧后PEG骨架分解，机械强度较煅烧前有所下降，导致模板抽出时摩擦力对固定相造成破坏。e中固定相形貌较好，整体孔道呈现规整的圆形，且固定相存在多孔结构。b和f所示金丝上并无固定相附着，d和h中金丝上均附着有少量固定相。故，最佳脱除模板时机为程序升温后。
[0085] 实施例4
[0086] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，醋酸溶液的pH值依次分别为：1、2、3、4和5，具体结果见图3。
[0087] 其中，图3中的a和b对应的是pH值为1；c和d对应的是pH值为2； e和f对应的是pH值为3；g和h对应的是pH值为4，i和j对应的是pH值为5。
[0088] 在图3中，a和c中固定相过于致密，几乎看不到孔隙的存在。并且收缩率过大导致孔道尺寸比模板尺寸大很多，虽然有助于金丝脱除，但固定相开裂不利于该柱的色谱性能。i中固定相收缩率较小且机械强度不够，导致金丝抽出时摩擦力破坏了固定相结构，且从j可以看出金丝上还粘附少量的固定相颗粒。然而，e和g中的固定相则在金丝移除后依旧完美的保持了开管结构，形成贯穿孔道且固定相存在明显的多孔结构。孔道直径约为56μm，这是因为纯硅胶柱具有一定的收缩性，故孔道直径比金丝直径稍大，有利于模板的脱除。同时f和h金丝光洁，表面上并无固定相附着。因此，选择制备硅胶整体开管毛细管柱体系的最佳pH为3‑4。
[0089] 图3中的e对应的固定相收缩率是32％；g对应的固定相收缩率是28％。
[0090] e中孔道尺寸约为58μm，固定相厚度约为8.5μm，收缩率约为32％，毛细管内径与涂层厚度之比为8.8；g中孔道尺寸约为57μm，固定相厚度约为 9μm，收缩率约为28％，毛细管内径与涂层厚度之比为8.3。可以看出当体系pH不同时，固定相收缩率不同，进一步导致固定相厚度不同，从而实现对固定相厚度的调控。同时，也可以通过其余实验条件控制固定相收缩率发生变化，在此不一一赘述。但是，收缩率过大或过小都会对硅胶整体开管毛细管柱的制备造成不良影响，因此通过收缩率控制固定相厚度进行调控的区域不大，优选为28‑32％。
[0091] 实施例5
[0092] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，聚乙二醇依次分别为： PEG‑400、PEG‑2000、PEG‑4000和PEG‑20000，具体结果见图4。
[0093] 其中，图4中的a和b对应的是PEG‑400；c和d对应的是PEG‑2000； e和f对应的是PEG‑4000；g和h对应的PEG‑10000(即为实施例1的产物，但是由于表征的是同一毛细管柱的不同位置，故与图1中c和d存在细微差异)，i和j对应的是PEG‑20000。
[0094] 在图4中，a、c和e中固定相基本看不到孔隙，并且收缩率很大导致固定相严重开裂，g中毛细管壁上形成均匀的硅胶整体固定相，且孔道尺寸约为56μm，较50μm的金属细丝尺寸稍大，故在金丝脱除后固定相依旧保持原本的形貌。b、d、f、h和j都未发现金丝上粘附有固定相的现象，但i中的固定相受到了一定的破坏。分析当PEG分子量过小时，可能因为分子链较短，被其包裹的硅溶胶小颗粒不能有效的分开，迅速团聚导致硅材料堆积，无法形成多孔材料。虽然固定相收缩后给金丝的脱除留下一定空间，但开裂会导致该柱色谱行为不佳。但是，若PEG分子量过大会使得交联程度很大，导致微米级孔尺寸增大且分布不均，机械强度有所下降。虽然固定相存在一定的收缩率，但在脱除金丝时固定相结构仍遭到摩擦力破坏。只有当PEG 分子量适中时，固定相既具有一定的收缩率又具有一定的机械强度，才能够使得模板脱除后保留原貌。故PEG的最优分子量为10000。
[0095] 实施例6
[0096] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，PEG‑10000添加量依次分别为：0.104g、0.114g、0.134g和0.144g，具体结果见图5。
[0097] 图5中的a和b对应的是0.104g；c和d对应的是0.114g；e和f对应的是0.124g(即为实施例1的产物)；g和h对应的0.134g，i和j对应的是0.144g。
[0098] 在图5中，a和c中PEG加入量偏少，最终会形成颗粒状的硅球堆积在一起，连续性差机械强度差，脱除模板时使固定相遭到了严重破坏。且b和 d中脱除的金丝模板上粘附着大量的固定相，但d较b有所改善。随着PEG 加入量的逐渐增加，交联程度会随之增强，使网络骨架和孔径尺寸减小，固定相变得更加致密，机械强度增加有利于模板的脱除。如i所示，由于太致密导致过大的收缩率，从而引起固定相开裂，不利于柱效。而g中的固定相呈现不规则的形貌，存在部分骨架堆积。e所显示的固定相完整，孔道尺寸约为56μm且内壁能看到明显的多孔结构。f、h和j中金丝表面洁净，并未观察到固定相附着。故PEG的最优加入量为0.124g。
[0099] 实施例7
[0100] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，TMOS加入量依次分别为： 300μL、350μL、450μL和500μL，具体结果见图6。
[0101] 图6中的a和b对应的是300μL；c和d对应的是350μL；e和f对应的是450μL；g和h对应的500μL。
[0102] 图6中的a和c具有较大的微孔孔径，且有成球趋势，机械强度差，导致脱除模板时摩擦力对固定相形貌造成破坏，但c较a有所改善。图6中的 b中金丝上粘有非常少量的固定相，图6中的d、f和h中的金丝均是光洁的。图6中的e和g中的固定相均过于致密，收缩率较大孔道直径偏大，模板容易脱除但固定相开裂严重影响柱性能。因此，最优的TMOS加入量为400μL。
[0103] 实施例8
[0104] 按照实施例1的方法进行，唯一不同的是，金丝的直径依次分别为： 25μm、40μm；第二毛细管的窄口端的最窄处的内径均比金属丝的直径大 3μm，具体结果见图7。
[0105] 图7中的a和b对应的是25μm；c和d对应的是40μm；e和f对应的是50μm(即为实施例1的产物，但是由于表征的是同一毛细管柱的不同位置，故与图1中c和d存在细微差异)。
[0106] 图7中a中固定相发生开裂，猜测是由于模板尺寸过小，导致固定相层太厚。这时，还按照原来实验条件约30％的收缩率就导致了收缩尺寸过大，无法保持规整的圆形孔道，发生开裂。但是并未出现其余方法制备较厚固定相硅基PLOT柱时，受重力作用导致固定相分布不均的情况。图7中c和d 所使用的模板是国内定制的40μm金丝，明显看出尺寸不标准且不成规整的圆柱形。但仍然可以看出固定相并未发生开裂现象，且孔道尺寸比e中的小。说明通过改变模板尺寸，可以达到对固定相厚度进行调控的目的。综上，在一定范围内改变模板尺寸来调节固定相厚度是可行的，但是要求模板尺寸和形貌必须标准。若想通过进一步减小模板尺寸来获得更厚的固定相层，就需要对固定相收缩率进行调节，以保证固定相不开裂。
[0107] 实施例9
[0108] 按照实施例1的方法进行制得一系列开管柱，唯一不同的是，色谱柱毛细管的内径依次分别为：55μm、60μm，具体结果见图8。
[0109] 图8中的a对应的是55μm；b对应的是60μm；c对应的是75μm(对应为实施例1的产物)。
[0110] 在图8中，可以看出固定相厚度随着毛细管内径的逐渐减小而不断变薄，且无论多大尺寸都保持良好的规整性、多孔性和均匀性，成功实现了对不同内径毛细管的固定相层厚控制。同时，有望使用模板法进一步制备更宽管径和更厚固定相层的硅胶整体开管毛细管柱。
[0111] 此外，需要说明的是，在图1‑7中，第一列的图均为所制备的硅胶整体开管毛细管柱横切面的SEM图，第二列均为制备完成后从毛细管柱内脱除的模板的SEM图。
[0112] 检测例1
[0113] 对实施例1和4制得的毛细管中的固定相进行氮吸附‑脱附测试，具体结果见图9‑1和图9‑2，由图可知，pH为1和2时固定相的比表面积较大，孔径较小，pH为3‑5时固定相的比表面积和平均孔径相差不大。
[0114] 检测例2
[0115] 按照实施例1的方法进行制得一系列开管柱，唯一不同的是，将步骤3) 中烘箱的温度依次设置为20℃、30℃、40℃、50℃和70℃，将得到的毛细管和实施例1中得到的毛细管进行固定相的氮吸附‑脱附测试，具体结果见图10‑1和图10‑2，由图可知，陈化温度为20℃时固定相的比表面积稍大，其余固定相的比表面积都相差无几，陈化温度为50℃或60℃时固定相的孔径分布峰值较大。
[0116] 检测例3
[0117] 对实施例1中煅烧前后的固定相进行氮吸附‑脱附测试，具体结果见图 11‑1和图11‑2，由图可知，煅烧前比煅烧后的固定相比表面积稍大，孔径稍小，推测应该是由于煅烧时有机物分解所导致的。
[0118] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0119] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0120] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
