[0004] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种棉粕的生物 脱毒方法，其工艺简单、成本和能耗低、适应性强、易于批量生产、脱毒效果稳定且效果好， 为微生物与化学方法相结合的棉粕脱毒方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种棉粕的生物脱毒方法，该方法包括以下几个步骤：
[0006] a、制备液体菌种：将枯草芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢 杆菌各1株分别接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在30°C -37 180r/min-220r/min条件下，摇床振荡培养24_36h，使该种子培养液中各菌体浓度分别达 到IO8-IO9CfuAiL ；将1株酵母菌属酵母接种一环斜面菌种细胞于酵母液体培养基中，在 28V -30°C,180r/min-220r/min条件下，摇床振荡培养24_36h，使该种子培养液中菌体浓 度达到108-109cfu/mL，将该两种种子培养液按1 :1混合即得液体菌种，作为固体菌种的生 产菌种；
[0007] b、制备固体菌种：按重量百分比取麦麸50%_60%、油糠30%_40%、葡萄糖2%_3%、硫 酸铵1. 5%-2. 0%、碳酸钙0. 4%-0. 5%、及棉粕5. 0%_6. 5%混勻，调节含水重量为45%_50%制成 固体菌种培养基，120-130°C灭菌55-65min，冷却至35_45°C，按1. 0%_1. 5%接种重量接种液 体菌种，于35-45°C恒温堆积培养5-6天后于50°C干燥制得；
[0008] C、棉粕发酵脱毒：按重量百分比取棉粕80%_85%、麦麸12 %_18%、葡萄糖 1. 0%-2. 5%、尿素0. 6%-1. 0%、七水硫酸亚铁0. 1%-0. 15%、及浓度为40000_60000U/g的中性 木聚糖酶0. 125%-0. 15%混勻，调节含水重量为50%-55%制成棉粕发酵脱毒培养基；再将b 步骤的固体菌种以1%_3%的接种重量接种到该棉粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成 高0. 6-0. 8m,长度不限的条垛，上面覆盖草帘，45°C _55°C下发酵4_5天，干燥后即得脱毒棉 粕。
[0009] 上述步骤a中的液体扩大肉汤营养培养基是按IOOOmL水加10_20g葡萄糖、5_10g 蛋白胨、3_5g牛肉膏、及3-5g氯化钠的比例，于水中加入葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、及氯化 钠，搅勻，在0. IMPa压力下灭菌25min，冷却至30°C而成。
[0010] 上述步骤a中的酵母液体培养基是按IOOOmL水加入20_40g葡萄糖、1. 5_2. Og酵 母浸膏、1. 0-1. 5g氯化钾、及8. 0-9. Og醋酸钠的比例，于水中加入葡萄糖、酵母浸膏、氯化 钾、及醋酸钠，搅勻，在0. IMPa压力下灭菌25min，冷却至30°C而成。
[0011] 本发明中用到的菌种均为现有技术，保藏号分别为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)：ACCCl 1062、CGMCC2548、或 CGMCC1222 ；侧胞芽孢杆菌（Baci 1 Ius Iateraporus)： CGMCC1755 或 CGMCC9701 ；纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto) ：CCTCC M207147、 CGMCC 0724 或 ATCC 6051 ；蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus) ：CGMCC 0759 或 CCTCC M209096 ；酵母属酵母菌（Saccharomyces) :CGMCC 1147, CGMCC 0702 或 CGMCC 0133。
[0012] 本发明提及的斜面菌种细胞中的菌种分别是与本发明中用到的枯草芽孢杆菌、侧 胞芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和酵母菌相对应的，即枯草芽孢杆菌所接种的斜 面菌种细胞中的菌种为枯草芽孢杆菌，其它类推。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0014] (1)在本发明方法的处理过程中，选用芽孢杆菌作为主要发酵脱毒菌种。因为发酵 脱毒菌种的芽孢具有极强的抗逆性，选用的菌种在生长过程中不仅可以降低棉粕中的游离 棉酚，还可产生各种各样的代谢产物和促生长物质，并可解决饲料在干燥过程中存在的一 些问题，达到良好的稳定性和促进动物肠道有益微生物生长的作用。
[0015] (2)本发明方法使用的化学物质七水硫酸亚铁中的Fe2+能与双醛式游离棉酚反应 生成变性棉酚，从而使棉粕脱毒。在棉粕利用微生物发酵脱毒过程中，加入七水硫酸亚铁，可利用微生物发酵产生的热量，促进游离棉酚的转化，同时，还可改善由于七水硫酸亚铁的 加入导致棉粕适口性不好的问题。
[0016] (3)本发明方法使用的中性木聚糖酶，能有效地降低棉粕中游离棉酚和结合棉酚 的含量，从而协同微生物和七水硫酸亚铁发酵棉粕，达到快速脱毒的目的。
[0017] (4)本发明具有生产工艺简单、能耗低、无三废、投资小、易于规模化生产等特点。
[0018] (5)以我国现有工艺生产的未脱毒棉粕为原料棉粕，采用本发明方法进行脱毒，其 游离棉酚含量可降低95%以上，游离氨基酸总量提高15%以上，总蛋白质含量提高10%以 上，可作为畜禽和水产动物蛋白饲料使用。
[0019] 具体实施方式：
[0020] 以下实施例对本发明作进一步说明。
[0021] 实施例1 ：
[0022] 本实施例1所用的菌种为枯草芽孢杆菌1株、侧胞芽孢杆菌1株、侧胞芽孢杆菌1 株、纳豆芽孢杆菌1株、蜡状芽孢杆菌1株以及酵母属酵母菌1株。其步骤为：
[0023] (1)液体菌种制备：取IOg葡萄糖、5g蛋白胨、3g牛肉膏、3g氯化钠和IOOOmL自 来水（pH7. 2)搅勻，组成枯草芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌菌种 的液体扩大肉汤营养培养基，在0. IMPa压力下灭菌25min，冷却至30°C后接入培养成熟的 斜面菌种，分别于37°C、180r/min下，摇床培养24h ；取20g葡萄糖、1. 5g酵母浸膏、Ig氯化 钾、8g醋酸钠和自来水IOOOmL (pH5. 5)搅勻，组成酵母液体培养基，在0. IMPa压力下灭菌 25min，冷却至30°C后接入培养成熟的斜面菌种，分别于28°C、180r/min下，摇床培养24h ； 取上述两种种子培养液按1 :1混合得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种。
[0024] (2)固体菌种制备：取50kg麦麸、40kg油糠、2kg葡萄糖、1.5kg硫酸铵、0.4kg碳 酸钙、6. Ikg棉粕混勻，用自来水调节含水重量为45%，制成棉粕发酵脱毒培养基，120°C灭 菌65min，冷却至37°C后，按重量接入1%的液体菌种(各菌种的比例为1 :1)，37°C恒温培养 5天，50°C条件下干燥，作为发酵脱毒固体菌种。
[0025] (3)取棉粕80kg、麦麸17kg、葡萄糖1. 9kg、尿素0. 87kg、七水硫酸亚铁0. 1kg、及中 性木聚糖酶（40000U/g)0. 13kg混勻，调节含水重量50%制成棉粕发酵脱毒培养基。于IOOkg 该培养基(培养基中含有0. 198%游离棉酚）中加入Ikg发酵脱毒固体菌种，混合均勻，堆成 高0.6m，长度不限的条垛，上面覆盖草帘，45°C温度下发酵4d，干燥后即得脱毒棉粕。取样 分析棉粕中游离棉酚含量为0. 0081%，脱毒率为95. 9%，蛋白质含量42. 7% (提高11. 5%)，游 离氨基酸含量提高16. 2%。
[0026] 实施例2 ：
[0027] 本实施例中所用菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 1株、侧胞芽孢杆菌 (Bacillus lateraporus) 1 株、纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto) 1 株、蜡状芽孢 杆菌（Bacillus cereus) 1株以及酵母属酵母菌（Saccharomyces) 1株。其步骤为：
[0028] (1)液体菌种制备：取15g葡萄糖、5g蛋白胨、5g牛肉膏、3g氯化钠和IOOOmL自来 水（PH7. 5)搅勻，组成枯草芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌菌种的 液体扩大肉汤营养培养基，在0. IMPa压力下灭菌25min，冷却至30°C后接入培养成熟的斜 面菌种，分别于30°C、220r/min下，摇床培养36h;取30g葡萄糖、1.7g酵母浸膏、Ig氯化钾、 8. 5g醋酸钠和自来水IOOOmL (pH5. 0)搅勻，组成酵母液体培养基，在0. IMPa压力下灭菌525min，冷却至30°C后接入培养成熟的斜面菌种，分别于30°C、220r/min下，摇床培养36h ； 取上述两种种子培养液按1 :1混合得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种。
[0029] (2)固体菌种制备：取60kg麦麸、30kg油糠、3kg葡萄糖、1. 5kg硫酸铵、0. 4kg碳酸 钙、5. Ikg棉粕混勻，按重量比用自来水调节其含水量为50%，125°C灭菌60min，冷却至35°C 后，按重量接入1.2%的液体菌种(各菌种的比例为1 :1)，35°C恒温培养6天，50°C条件下干 燥，作为发酵脱毒固体菌种。
[0030] (3)取棉粕85kg、麦麸12kg、葡萄糖2kg、尿素0. 75kg、七水硫酸亚铁0. 1kg、及中 性木聚糖酶（50000U/g) 0. 15kg混勻，调节培养基含水重量55%制成棉粕发酵脱毒培养基。 于IOOkg该培养基(培养基中含有0. 198%游离棉酚）中加入2kg发酵脱毒固体菌种，混合 均勻，堆成高0. 6m，长度不限的条垛，上面覆盖草帘，50°C温度下发酵5d，干燥后即得脱毒 棉粕。取样分析棉粕中游离棉酚含量为0. 0074%，脱毒率为96. 3%，蛋白质含量47. 3%(提高 13. 1%)，游离氨基酸含量提高18. 9%。。
[0031] 实施例3:
[0032] 本实施例所用菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 1株、侧胞芽孢杆菌 (Bacillus lateraporus) 1 株、纳豆芽抱杆菌（Bacillus subtilis natto) 1 株、赌状芽抱 杆菌（Bacillus cereus) 1株以及酵母属酵母菌（Saccharomyces) 1株。其步骤为：
[0033] (1)液体菌种制备：由20g葡萄糖、IOg蛋白胨、4g牛肉膏、4g氯化钠和IOOOmL自 来水（pH7. 4)组成枯草芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌菌种的液体 培养基；取40g葡萄糖、2. Og酵母浸膏、1. 5g氯化钾、9g醋酸钠、自来水IOOOmL (ρΗ4· 5)组 成酵母菌液体培养基。在0. IMPa压力下灭菌25min，冷却至30°C后接入培养成熟的斜面菌 种，分别于28V (酵母菌)、35°C (细菌）温度下，200r/min，摇床培养28h，作为固体菌种的 生产菌种。
[0034] (2 )固体菌种制备：取55kg麦麸、35kg油糠、2. 5kg葡萄糖、2. Okg硫酸铵、0. 5kg碳 酸钙、5. Okg棉粕混勻，按重量比用自来水调节其含水量为45%，130°C灭菌55min，冷却至 45°C后，按重量接入1. 5%的液体菌种(各菌种的比例为1 :1)，45°C恒温培养6天，50°C条件 下干燥，作为发酵脱毒固体菌种。
[0035] (3)取棉粕84kg、麦麸13. 6kg、葡萄糖1. 5kg、尿素0. 6kg、七水硫酸亚铁0. 15kg、 及中性木聚糖酶（60000U/g)0. 15kg混勻，调节培养基含水重量55%制成棉粕发酵脱毒培养 基。于IOOkg该培养基(培养基中含有0. 167%游离棉酚)中加入3kg发酵脱毒固体菌种，混 合均勻，堆成高0. 8m，长度不限的条垛，上面覆盖草帘，55°C温度下发酵5d，干燥后即得脱 毒棉粕。取样分析棉粕中游离棉酚含量为0.007%，脱毒率为95.8%，蛋白质含量41. 7% (提 高10. 7%)，游离氨基酸含量提高15. 6%。
