[0038] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 以下具体实施例中所使用的材料均可通过常规方式购买得到，所采用的菌株分离和培养方法均为本领域熟知选用的，涉及到的％除特别指出外都为重量百分比。
[0040] 实施例1芽孢杆菌Mangrove‑2008的分离获得
[0041] 选取深圳坝光红树林(N22°39′，E114°30′)作为采集点，取少量采集的海泥匀浆，2 7 5 7
在无菌试管中进行常规10x梯度稀释，获得稀释度为10‑ ‑10‑ 6个梯度样品。从10‑‑10‑ 3个浓度梯度样品分别取200μL样品稀释液分别涂布于LB、NA、马铃薯培养基PDA、牛肉膏蛋白胨培养基ND的固体分离培养基上，37℃培养2‑3天后观察菌落。按其边缘形状、颜色，形态、的差别，从平板中挑取典型菌落利用三区划线法接种于对应的分离培养基上，获取纯单菌株。最终将分离得到的纯培养物接种于相应的斜面培养基，保存在4℃冰箱备用。
[0042] 挑选已成熟的菌株接种在发酵培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养2d，取上清液测定抗菌活性，设置三个重复组，采用琼脂扩散法。初筛用滤纸片法：用打孔器裁剪出直径为5mm的滤纸片，经高压蒸汽灭菌后取两层滤纸片沾取发酵上清液，放置在已加有黑曲霉的平板表面，每个样品设置3个重复组，培养1‑2d，测量后比较产生的抑菌圈直径大小，复筛方法同初筛。筛选得到一株对黑曲霉具有明显拮抗作用的菌株Mangrove‑2008。
[0043] 实施例2芽孢杆菌Mangrove‑2008的观察与鉴定
[0044] 将菌株Mangrove‑2008接种于LB培养基上，观察并记录菌落的状态，其菌落形态如图1所示，划线培养结果如图2所示。测量菌落的直径大小，有无菌膜等；并对Mangrove‑2008菌株用化学染料进行芽孢染色、革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察并记录其结果。其菌落特征如表1所示，芽孢染色如图3所示。
[0045] 采用常规方法提取16S DNA，进行PCR扩增，产物由湖南擎科生物技术有限公司测序。测序结果用MEGA 6.0构建系统进化树，如图4所示。
[0046] 结合该菌的生理生化、微生物学检测结果，以及16S rDNA测序结果(见SEQ ID NO.1)，最终确定菌株Mangrove‑2008为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
[0047] 表1 Mangrove‑2008菌落特征
[0048]
[0049] 实施例3芽孢杆菌Mangrove‑2008的培养条件优化
[0050] 1.菌株基础培养基的筛选
[0051] 选用LB培养基、PDA培养基、YEB培养基、NA培养基、肉汤琼脂培养基五种培养基进行筛选。挑取生长成熟的菌株，接种于基础液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h制成种子液，取3％种子液分别接种于不同的培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h，观察比较结果，菌液浓度均通过分光光度计OD600测定，如图5所示，结果显示芽孢杆菌Mangrove‑2008在NA培养基上生长效果最佳，因此选用NA培养基作为后续研究的基础培养基。
[0052] 2.菌株生长曲线的测定
[0053] 挑取生长成熟的菌株，接种于基础液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养，每隔2h取样一次，在OD600下测定菌液的浓度，连续测量24h，绘制生长曲线如图6所示，在基础培养基上Mangrove‑2008的生长曲线为典型的“S”型曲线，并且在12h左右达到生长量的高峰。
[0054] 3.培养条件的优化
[0055] 在以NA为基础培养基，选择不同碳源、氮源、无机盐等单因素的实验基础上，经过正交实验优化配比，筛选出最佳培养基组合。菌液浓度均通过分光光度计OD600测定。
[0056] (1)培养基组分种类优化
[0057] 在NA基础培养基的其它组分不改变的情况下，分别以葡萄糖、木糖、马铃薯淀粉、蔗糖作为碳源，以酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3、KNO3作为氮源，以NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4+K2HPO4(1:1)复合盐和ZnSO4·7H2O作为基础培养基中的无机盐，分别制成液体培养基，并加入3％种子液，200r/min，37℃恒温震荡培养12小时，设置3个重复组，OD600测定菌液浓度，获得最优的碳源、氮源、无机盐。
[0058] 如图7、图8、图9所示，Mangrove‑2008菌株对葡萄糖的利用能力最强，以酵母提取物作为氮源时菌体的生长情况显著优于其他氮源，菌株生长的最佳无机盐为MgSO4·7H2O。
[0059] (2)培养基组分浓度优化
[0060] 在已知最优单因素、NA基础培养基中的其他组分不改变的条件下，碳源的质量分数固定为0.1％、0.2％、0.25％、0.4％、1.0％、2.0％，氮源质量分数为0.3％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％和1.5％，无机盐离子质量分数为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，摇瓶培养方法同上，获得最优的单因素浓度。
[0061] 如图10所示，发酵培养基中葡萄糖质量分数为1.0％时，Mangrove‑2008菌体生长量最大，OD值达到2.044，从而确定葡萄糖的最佳质量分数为1.0％。
[0062] 如图11所示，Mangrove‑2008的OD值在0.3％‑1.0％之间变化不大，当酵母提取物质量分数达到1.2％时OD值达最大值1.942，然后开始缓慢下降。因此酵母提取物的最佳质量分数为1.2％。
[0063] 如图12所示，Mangrove‑2008的OD值随着MgSO4·7H2O的质量分数的增大呈现先上升后下降的趋势，在镁离子浓度达到0.4％时，菌体的生长量处在较高的水平，OD值也达到了最大值。因此Mangrove‑2008的最优无机盐MgSO4·7H2O的最佳质量分数为0.4％。
[0064] (3)正交实验
[0065] 通过以上的单因素实验，确定了芽孢杆菌Mangrove‑2008生长所需的最优碳源、氮源、无机盐及其浓度。选用3因素3水平L9(33)正交表对这三个因素进行实验，以此确定培养基中各组分的最佳配比。
[0066] 表2 Mangrove‑2008正交实验因素和水平
[0067]
[0068] 表3 Mangrove‑2008正交实验指标结果
[0069]
[0070] 表4 Mangrove‑2008正交实验方差分析
[0071]
[0072] 根据单因素实验Mangrove‑2008生长所需最佳培养基的最佳组合，推得Mangrove‑2008的最佳培养基为：葡萄糖1％，酵母提取物1.2％，MgSO4·7H2O0.4％。由表3可知，极差值的大小为B>A>C，即影响Mangrove‑2008菌株菌体生长的因素主次顺序分别为：酵母粉>葡萄糖>MgSO4·7H2O。
[0073] 根据正交实验的结果可以确定各组分的零水平并优化其配比，由此得到的最适培养基为：Mangrove‑2008：葡萄糖2％，酵母提取物2.4％，MgSO4·7H2O 0.2％，小牛浸膏0.3％，NaCl 0.5％。
[0074] 4.发酵条件的优化
[0075] 在以获得的最佳培养基为基础培养基，选择不同pH(6、7、8)、温度(28℃、37℃、46℃)、转速(150r/min、180r/min、210r/min)等单因素进行实验，经过实验得到最佳条件，筛选出最佳发酵条件，菌液浓度测定同上。
[0076] (1)将Mangrove‑2008最优培养基的初始pH分别调至6、7、8，摇瓶发酵培养12h，利用分光光度计测定OD600，由图13可知，随着pH值的增大，OD值也随之增大，在pH为8时达到了最大值。说明Mangrove‑2008在弱酸性和中性条件下可以生长，而在偏碱性条件下生长更好，因此选择8为Mangrove‑2008的最适pH值。
[0077] (2)将Mangrove‑2008最优培养基分别置于28℃、37℃、46℃下进行培养，测定方法同上，由图14可知，Mangrove‑2008在46℃培养时菌体中的酶因为温度过高而逐渐失活，因此OD值急剧下降，菌体生长量明显变小。而在28℃、37℃下长势良好，并在28℃时OD值达到了最大，因此选择28℃作为Mangrove‑2008的最适温度。
[0078] (3)将Mangrove‑2008最优培养基分别置于150r/min、180r/min、210r/min下进行培养，测定方法同上，由图15可知，Mangrove‑2008在转速为180r/min时OD最大，达到1.92，因此选择180r/min为最佳转速。
[0079] 实施例4芽孢杆菌Mangrove‑2008的抑菌效果
[0080] 在超净工作台上，选择生长成熟的菌株Mangrove‑2008，挑取单菌落接种于最佳液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h，制成种子液。将得到的菌液离心，使用滤网将菌体过滤，得到上清液，同时将过滤的菌体用无菌水配制成菌悬液。
[0081] 1.不同浓度Mangrove‑2008培养上清液对黑曲霉菌丝生长的抑制作用[0082] 在PDA培养基中加入不同量的Mangrove‑2008培养上清液制成带药培养基，倒平板，固定平板体积为25ml，使得最终培养上清液的含量分别为2ml、4ml、6ml、8ml，以不加Mangrove‑2008培养上清液的平板作为对照，将黑曲霉分别接种于不同梯度浓度培养上清液的PDA平板中间，设置3组重复，28℃恒温培养。每天观察并记录数据，算出抑菌率。
[0083] 菌落生长抑制率＝(对照生长直径－处理生长直径)/对照生长直径×100％。
[0084] 如图16和图17所示，正常生长的黑曲霉菌丝体均匀地分布于整个PDA培养基平板上，菌丝体生长良好，孢子成长较好，而经处理的黑曲霉生长出现明显抑制效果。随着发酵液浓度的不断增加其抑制效果越明显，在6mL的发酵液浓度下抑制效果变得明显，8mL的发酵液浓度基本可以抑制住黑曲霉孢子的生长。Mangrove‑2008菌株8mL的发酵液对黑曲霉的抑菌率可达到78.70％。
[0085] 2.不同浓度Mangrove‑2008培养上清液和不同浓度Mangrove‑2008菌悬液对馒头黑曲霉生长的抑制作用
[0086] (1)取适量面粉灭菌后做成糊状均匀平铺在平板中，将在摇床中培养12h的种子液过滤除菌得到上清液，取5ml未经稀释、稀释1倍、稀释2倍的上清液分别加入平板，再将1μl黑曲霉液滴于平板中央，设置3组重复。28℃培养2天，观察黑曲霉生长情况。
[0087] 如图18和图19所示，三个梯度的滤液平板中黑曲霉均有不同程度的抑制效果，其中未经稀释的滤液对黑曲霉的抑制效果最好，抑菌率超过80％。
[0088] (2)取适量面粉灭菌后做成糊状均匀平铺在平板中，将Mangrove‑2008培养液过滤7 8 9
得到的菌体用无菌水分别配制成浓度为1×10cfu/ml、1×10 cfu/ml、1×10cfu/ml的菌悬液，各取5ml分别加入平板，再将1μl黑曲霉液滴于平板中央，设置3组重复。28℃培养2天，观察黑曲霉生长情况。
[0089] 如图20所示，三个浓度梯度的菌悬液对黑曲霉均有不同程度的抑制效果，其中浓7 8
度为1×10 cfu/ml的菌悬液抑菌率为56.3％，浓度为1×10 cfu/ml的菌悬液抑菌率为
9
85.5％，浓度为1×10cfu/ml的菌悬液抑菌率达到93.6％。
[0090] 综上所述，菌株Mangrove‑2008可以有效防治黑曲霉对面食制品的污染，具有较高的实际利用与开发价值。
