[0024] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0025] 本发明的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的抑菌活性检测方法和结果如下所述。
[0026] 含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的抑菌活性检测方法，具体操作为：
[0027] (1)取含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物(其活性成分为U1、U3、U4或U27的一种或几种的组合物)干粉溶于无菌水至0.5mg/mL；
[0028] (2)准备固体LB平板活化受试菌种大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、嗜水气单孢菌，37℃培养过夜((金黄色葡萄球菌培养24h))，挑取一个单菌落分别接种于液体LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养过夜(金黄色葡萄球菌培养24h)
[0029] (3)分别取1mL培养好的菌液加入50mL已融化的固体LB培养基，充分混匀后倒入培养皿，待其冷却凝固，制成含菌平板；
[0030] (4)打孔，分别加入步骤(1)中粗蛋白U1、U3、U4、U27的饱和溶液，置于37℃培养后观察抑菌圈大小，并测量其直径。
[0031] 同时，金黄色葡萄球菌和嗜水气单孢菌以0.2μg/μL Kan(卡那霉素)为对照，大肠杆菌和沙门氏杆菌以0.2μg/μL Amp(氨苄青霉素)为对照，结果如图1所示。
[0032] 由图1可知，四种表达产物对金黄色葡萄球菌、嗜水气单孢菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌均有不同程度的抑制作用，且含U1、U3、U4或U27活性成分的抗菌组合物对金黄色葡萄球菌的抑菌强度显著优于常规的抗菌药剂0.2μg/μL Kan(卡那霉素)，含U3或U27活性成分的抗菌组合物对嗜水气单孢菌的抑菌强度与常规的抗菌药剂0.2μg/μL Kan(卡那霉素)相当，含U3或U27活性成分的抗菌组合物对大肠杆菌的抑菌强度与常规的抗菌药剂0.2μg/μL Amp(氨苄青霉素)相当，含U1、U3、U4或U27活性成分的抗菌组合物对沙门氏杆菌的抑菌强度相对常规的抗菌药剂0.2μg/μL Amp(氨苄青霉素)较弱，但其抗菌活性也能达到常规抗菌药剂的65％左右。综上所述，本发明含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物对革兰氏阳性菌体有显著抗菌效果，同时，对革兰氏阴性菌也具有一定的抗菌效果。
[0033] 本发明的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的活性成分——重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4或U27的一种或几种的组合物，均可通过含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4或U27的制备方法具体操作如下：
[0034] 1)蜘蛛多肽毒素真核表达载体的构建
[0035] a.引物设计
[0036] 根据蜘蛛多肽毒素U1、U3、U4、U27序列设计引物，在序列的5’端和3’端分别引入核酸酶切位点XbaⅠ和HindⅢ和相应的保护碱基，并在序列的5’端引入蛋白酶切位点(LDKR)。
[0037] b目的基因的获得以实验室保存的cDNA文库中pDNR‑LIB‑U1，pDNR‑LIB‑U3，pDNR‑LIB‑U4，pDNR‑LIB‑U27为模板，采用特异性引物通过PCR扩增分别得到目的基因U1、U3、U4、U27。
[0038] C PCR扩增：通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别将目的片段U1、U3、U4、U27进行回收，具体步骤如下：
[0039] (1)在凝胶成像系统下，观察到片段大小相符的单一条带后，迅速切下含有目的基因的胶块，放入事先称好重量的1.5mL离心管中，称重，得到胶块重量；
[0040] (2)加入与胶块等体积的PN buffer(0.1g＝100μL)，置于50℃水浴锅中，其间适当温和地晃动，确保胶块充分溶解；
[0041] (3)将吸附柱与收集管进行组装后，加入500μL BL buffer对吸附柱进行平衡，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的液体；
[0042] (4)将冷却至适温的凝胶溶液转入吸附柱，静置10min后，12,000rpm离心1min，将收集管中的凝胶溶液再次转入吸附柱静置几分钟，以确保回收率，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；
[0043] (5)在吸附柱中加入600μL PW buffer，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；
[0044] (6)重复步骤(5)；
[0045] (7)将吸附柱放入收集管，12,000rpm离心2min，去掉残留的PW buffer；
[0046] (8)去掉收集管，将吸附柱放入干净无菌的1.5mL离心管中，打开吸附柱的盖子，静置几分钟，等待吸附柱中的乙醇彻底挥发；
[0047] (9)在吸附柱中加入30μL EB buffer，静置几分钟后，12,000rpm离心1min；
[0048] (10)将离心管中的液体重新加入吸附柱，静置几分钟后，12,000rpm离心1min，去掉吸附柱，将得到的目的基因置于‑20℃冰箱保存。
[0049] D目的基因及表达载体pVT102U/α的酶切
[0050] 采用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ对目的基因U1、U3、U4、U27及表达载体pVT102U/α进行酶切。
[0051] E目的基因与表达载体pVT102U/α的连接
[0052] 将切胶回收后的目的基因与表达载体通过T4连接酶连接,将配制好的连接体系置于恒温混匀仪中，16℃反应过夜。
[0053] F大肠杆菌感受态制备
[0054] (1)在LB平板上活化菌种，挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基，37℃过夜震荡培养，次日取菌液按1:50比例接种于50mL液体LB培养基，37℃震荡培养约1h，直至OD600达到0.4‑0.6，将菌液放置于4℃冰箱，预冷15min；
[0055] (2)提前预冷低温冷冻离心机，取1.4mL预冷的菌液于1.5mL离心管中，4℃，5,000rpm，3min离心后，去上清，收集菌体；
[0056] (3)重复步骤(2)；
[0057] (4)取750μL 0.1mol/L的CaCl2溶液将菌体重悬，冰盒上冰浴30min，4℃，5,000rpm，3min离心后，去上清，收集菌体；
[0058] (5)取200μL 0.1mol/L的CaCl2溶液将菌体重悬，冰盒上冰浴20min，加50μL 60％甘油，置于‑36℃冰箱保存。
[0059] G热激转化
[0060] (1)分别将四个不同目的基因的连接液加入100μL感受态细胞，冰浴30min；
[0061] (2)置于42℃水浴锅中热激90s后，迅速转入冰盒上冰浴2min；
[0062] (3)加入800μL新鲜液体LB培养基后，置于37℃培养箱中震荡培养1h；
[0063] 将菌液离心，3,000rpm，3min，在超净工作台上去上清，留200μL左右的上清重悬菌体，将菌悬液均匀涂布于含100mg/L Amp的固体LB平板上，37℃培养箱中倒置培养12h。
[0064] H克隆子鉴定及测序
[0065] 采用菌落PCR对克隆子进行鉴定，挑取转化平板上的单菌落，分别溶于20μL无菌的ddH2O中，作为菌落PCR的模板。
[0066] I酿酒酵母转化及表达
[0067] 将测序鉴定后的含有重组质粒的菌株进行活化，挑取单菌落接种于含100mg/L Amp的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h，采用质粒小提试剂盒提取重组质粒，具体操作如下：
[0068] (1)取1.4mL菌液于1.5mL离心管中，12,000rpm，1min离心，去上清；
[0069] (2)重复步骤(1)；
[0070] (3)彻底去除上清，加入250μL P1 buffer，重悬菌体后，加入250μL P2buffer，轻轻混匀后加入350μL P3 buffer，轻轻混匀，放置3min，12,000rpm，10min离心，取上清；
[0071] (4)将吸附柱与收集管进行组装后，加入500μL BL buffer对吸附柱进行平衡，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的液体；
[0072] (5)将步骤(3)中的上清液转入吸附柱，静置10min后，12,000rpm离心1min，将收集管中的溶液再次转入吸附柱静置几分钟，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；
[0073] (6)在吸附柱中加入600μL PW buffer，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；
[0074] (7)重复步骤(6)；
[0075] (8)将吸附柱放入收集管，12,000rpm离心2min，去掉残留的PW buffer；
[0076] (9)去掉收集管，将吸附柱放入干净无菌的1.5mL离心管中，打开吸附柱的盖子，静置几分钟，等待吸附柱中的乙醇彻底挥发；
[0077] (10)在吸附柱中加入30μL EB buffer，静置几分钟后，12,000rpm离心1min；
[0078] 将离心管中的液体重新加入吸附柱，静置几分钟后，12,000rpm离心1min，去掉吸附柱，将得到的重组质粒置于‑20℃冰箱保存。
[0079] 四个重组表达载体分别命名为pVT102U/α‑U1、pVT102U/α‑U3、pVT102U/α‑U4、pVT102U/α‑U27。
[0080] J酿酒酵母感受态的制备
[0081] (1)准备固体YPD固体培养基活化酿酒酵母S78，30℃倒置培养3‑4天。挑取大而尖的白色菌落接种于液体YPD培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h；
[0082] (2)将取1mL菌液接种于50mL新鲜的液体YPD培养基中，30℃，200rpm震荡培养至OD600为0.4‑0.6左右；
[0083] (3)将培养好的菌液静置15min后，转入无菌的50mL离心管，5,000rpm离心3min，去上清；
[0084] (4)离心管中加入20mL无菌水重悬菌体，5,000rpm离心3min，去上清；
[0085] (5)重复步骤(4)，收集菌体；
[0086] (6)准备溶液A，按10×TE溶液：1M LiAc溶液：ddH2O＝1:1:8的比例配制，取1.5mL溶液A重悬重复步骤(5)中的菌体，制成菌悬液。
[0087] K酿酒酵母转化及表达
[0088] (1)准备溶液B，按10×TE溶液：1M LiAc溶液：50％PEG4000＝1:1:8的比例配制；
[0089] (2)取4个无菌的10mL离心管，同时加入1.5mL溶液B、10μg carrier DNA、20μL菌悬液混匀，分别加入1μg重组表达载体pVT102U/α‑U1、pVT102U/α‑U3、pVT102U/α‑U4、pVT102U/α‑U27，混匀后30℃，200rpm孵育30min；
[0090] (3)将步骤(2)中的混合液置于42℃水浴锅中，热激15min，迅速转到冰盒上冰浴2min，5,000rpm离心3min，去上清，收集菌体；
[0091] (4)取200μL 1×TE溶液重悬菌体，5,000rpm离心3min，去上清，收集菌体；
[0092] (5)再次取200μL 1×TE溶液重悬菌体，5,000rpm离心3min，去掉大部分上清，留取200μL左右上清重悬菌体，将菌液均匀的涂布于缺陷型筛选培养基YSD上，30℃倒置培养5‑6天；
[0093] (6)从转化平板上挑取3‑4个状态较好的单菌落接种于10mL液体YSD培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h；
[0094] (7)将培养好的菌液按1:50的比例接种于50mL液体YSD培养基继代培养，30℃，200rpm震荡培养12h；
[0095] (8)再次将培养好的菌液按1:50的比例接种于液体YSD培养基中，30℃，200rpm震荡培养3‑4天，10,000rpm离心10min，收集上清(粗蛋白)，分装封口，‑36℃保存；
[0096] (9)将冷冻好的样品通过真空冷冻干燥机进行冻干，收集粗蛋白干粉，即为本发明的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的活性成分——重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4、U27，‑36℃保存。
[0097] 实施例1
[0098] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U27。
[0099] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为30％。
[0100] 所述U27由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因为如SEQ ID NO.4的核苷酸片段。
[0101] 所述U27的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8所示。
[0102] 申请人对本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度进行测定，具体方法为：
[0103] (1)取本实施例的抗菌组合物干粉溶于无菌水至0.5mg/mL；
[0104] (2)分别将本实施例的抗菌组合物溶液按比例稀释为1/10、1/50、1/100、1/200等不同浓度；
[0105] (3)准备固体LB平板活化受试菌种大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、嗜水气单孢菌，37℃培养到OD600nm值在0.1左右；
[0106] (4)将菌液按浓度梯度稀释到10‑4CFU/mL，取5μL重组白额高脚蛛毒素样品溶液与5μL稀释后的菌液充分混合后点样于LB固体培养基上，37℃培养过夜观察菌落生长情况；
[0107] (5)根据不同浓度的抗菌组合物菌落生长情况得出抑菌组合物浓度和菌落生长情况(即抑菌效果)的变化趋势线，进而确定其最小抑菌浓度。
[0108] 本实施的抗菌组合物的最小抑菌浓度为5.75μg/mL。
[0109] 含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的应用，所述抗菌组合物抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。
[0110] 实施例2
[0111] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U3。
[0112] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为45％。
[0113] 所述U3由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因为如SEQ ID NO.2的核苷酸片段。
[0114] 所述U3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6所示。
[0115] 采用实施例1的抗菌组合物的最小抑菌浓度的测定方法测定本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度，本实施的抗菌组合物的最小抑菌浓度为6.25μg/mL。
[0116] 含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的应用，所述抗菌组合物抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。
[0117] 实施例3
[0118] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U1。
[0119] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为60％。
[0120] 所述U1由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段。
[0121] 所述U1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0122] 采用实施例1的抗菌组合物的最小抑菌浓度的测定方法测定本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度，本实施的抗菌组合物的最小抑菌浓度为9.75μg/mL。
[0123] 含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的应用，所述抗菌组合物抗菌饲料添加剂。
[0124] 实施例4
[0125] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U4。
[0126] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为70％。
[0127] 所述U4由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因为如SEQ ID NO.3的核苷酸片段。
[0128] 所述U4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7所示。
[0129] 采用实施例1的抗菌组合物的最小抑菌浓度的测定方法测定本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度，本实施的抗菌组合物的最小抑菌浓度分别为10.25μg/mL。
[0130] 含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物的应用，所述抗菌组合物抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。
[0131] 实施例1～4中的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，其活性成分U27、U3、U1、U4
[0132] 实施例1～4中的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，其活性成分U27、U3、U1、U4的凝胶电泳图如图2所示，参照图2可知，泳道1的为蛋白质标准分子量，泳道2～5分别为U27、U4、U3、U1表达产物，目的蛋白U27的分子量大约为6.9kDa，目的蛋白U4的分子量大约为9.5kDa，目的蛋白U3的分子量大约为6.9kDa，目的蛋白U1的分子量大约为5.9kDa。
[0133] 实施例5
[0134] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U3和U27的组合物，其中重组白额高脚蛛毒素多肽U3和U27的重量比为1:1。
[0135] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为10％。
[0136] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽U3和U27均由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述U3和U27的重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因分别为如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4的核苷酸片段。
[0137] 采用实施例1的抗菌组合物的最小抑菌浓度的测定方法测定本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度，该抗菌组合物的最小抑菌浓度为5.2μg/mL。
[0138] 实施例6
[0139] 本实施例的一种含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，所述抗菌组合物由活性成分和辅料组成，所述活性成分为重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4和U27的组合物，其中重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4和U27的重量比为1:2:1:2。
[0140] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽占抗菌组合物的重量比为5％。
[0141] 所述重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4和U27均由含重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌发酵获得，所述U1、U3、U4和U27的重组白额高脚蛛毒素多肽编码基因分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的核苷酸片段。
[0142] 采用实施例1的抗菌组合物的最小抑菌浓度的测定方法测定本实施例的抗菌组合物的最小抑菌浓度，该抗菌组合物的最小抑菌浓度为5.6μg/mL。
[0143] 本发明的含重组白额高脚蛛毒素多肽的抗菌组合物，其中活性成分还可以为与所述U1、U3、U4、U27中任一多肽氨基酸序列同源性≥80％的白额高脚蛛毒素多肽，或者，由重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4和U27中的2种、3种物质形成的其他组合物，比如：活性成分包括按重量比为2:3的重组白额高脚蛛毒素多肽U1和U3两种物质的组合物，或按重量比为2:1的重组白额高脚蛛毒素多肽U3和U4两种物质的组合物，或者，活性成分包括按重量比为1：2:1的重组白额高脚蛛毒素多肽U3、U4和U27三种物质的组合物，或按重量比为1：2:3的重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U4和U27三种物质的组合物，以上技术特征的改变，本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施，故不再另作附图加以说明。
