[0033] 下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。
[0034] 铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)：来源于武汉水生所藻种保藏中心，培养条件：25℃，光照强度2500lx、光暗比12h：12h。
[0035] 铜绿微囊藻培养基采用BG11改良版，其成分为：NaNO3 15g，K2HPO4 0.4g， MgSO4·7H2O 0.75g，CaCl2·2H2O 0.36g，柠檬酸0.06g，EDTANa2 0.01g，Na2CO3 0.2g，A5液10mL，溶解到10L蒸馏水中；
[0036] A5液：H3BO3 0.286g，MnCl2·4H2O 0.186g，ZnSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O 0.039g，CuSO4·5H2O 0.008g，Co(NO3)2·6H2O 0.005g，溶解于100mL蒸馏水中，调节pH7.1。
[0037] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，全部溶于1L蒸馏水，调PH7.4。
[0038] M9培养基：取M9母液200mL加水700mL,加2mL1mol/L已灭菌的硫酸镁，加100μL已灭菌的1mol/L氯化钙；M9母液的成分为：64g磷酸氢二钠，15g磷酸二氢钾，2.5g氯化钠，5.0g氯化铵，加1L水灭菌。
[0039] 斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，全部溶于1L蒸馏水，调PH7.4，。
[0040] 含镉离子的母液1g/L：称取1.000g光谱纯金属镉，用优级纯硝酸溶解，然后用水稀释定容至1000mL。
[0041] 含镉的牛肉膏蛋白胨平板培养基：990mL牛肉膏蛋白胨培养基中加入10mL 的含镉离子的母液，配置成含镉浓度为10mg/L的固体培养基。
[0042] 实施例1
[0043] 菌株R1的筛选与鉴定
[0044] S1：将从安徽省芜湖市镜湖区镜湖中采集的腐烂的水华离心后，收集上清液；
[0045] S2：在无菌条件下将上清液10mL接种到90mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 180r/min、37℃振荡培养24h得到菌液；
[0046] S3：吸取0.1mL菌液接种到含镉浓度为10mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37℃倒置培养72d；
[0047] S4：将长势良好的菌落纯化后接种到斜面培养基，2～6℃保存待用，并将其命名为R1。
[0048] 所述步骤S4中，纯化的方法为挑取牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落，划线法接到含镉的牛肉膏蛋白胨培养基，平板倒置培养，再挑取菌落继续重复之前的步骤，直至菌落为单菌
[0049] 对R1菌株进行形态特征、生理生化特征鉴定，R1的菌落形态如图1所示，显微形态如图2所示。从图1、2中可见，R1的菌落形态为圆形，乳白色，光滑半透明，边缘整齐，较粘稠，易挑起；革兰氏染色阴性；菌体呈短杆状；无芽孢。对其进行生理生化鉴定的结果如下：能利用葡萄糖产生有机酸但不产气；不能分解含硫有机物和分解色氨酸产生吲哚；与大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌共培养做抑菌实验，它们相互之间无影响。
[0050] 并对菌株进行16S rDNA序列分析，PCR引物为细菌通用引物：27F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，双向测通。其基因序列表如SEQUENCE LISTING<400>1所示，序列长度为1396bp。将序列在NCBI数据库比对分析， 16S rDNA同源性比较见图3，结合形态学的观察，发现其与气单胞菌属 (Aeromonas)细菌的相似性高达99％。
[0051] 实施例2
[0052] 溶藻试验
[0053] 将一环R1菌株接种到200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180r/min、37℃培养30h得到R1菌液，其在620nm下，吸光度值为1.0。以下实施例中涉及到的R1菌液的制备方法均同此。
[0054] 所述铜绿微囊藻藻液的制备方法为：购入的藻种接入BG11培养基，每天摇藻，光照培养箱，25℃，光照强度2500lx、光暗比12h:12h培养。
[0055] 溶藻试验按表1设计进行。
[0056] 表1溶藻试验
[0057]
[0058]
[0059] 每组实验做3个重复，于25℃、光照强度2500lx、光暗比12h：12h条件下培养，每天观察铜绿微囊藻细胞形态变化和测定藻细胞叶绿素a的含量，其结果如图4所示，所有实验组铜绿微囊藻初始叶绿素a含量为1.98mg/L。实验组 A藻液中含有0.1mg/LCd2+，在接入R1菌液的第2天开始黄化，并出现絮状沉淀，在第4天就彻底黄化了，叶绿素a降到0.38mg/L。实验组B中藻液中不含镉，接入R1菌液后，第4天叶绿素a含量为0.79mg/L；由此可知，铜绿微囊藻液中是否有重金属镉离子，影响R1的溶藻效果，在镉离子存在的情况下，R1 溶藻效果更好。实验组C中并没有接入菌液的含镉藻液在第3天也有黄化的趋势，是因为重金属镉离子破坏了藻细胞，影响铜绿微囊藻正常生长。实验组D 中只接入培养基，藻细胞正常生长，叶绿素a含量一直增加。
[0060] 实施例3
[0061] R1菌株对藻毒素的降解试验
[0062] 将培养24h的R1菌液按照5％的体积比投放到以微囊藻毒素为底物的M9 培养基中，藻毒素初始浓度1.84mg/L，镉浓度0.1mg/L；另一实验组，M9培养基只含有藻毒素，浓度1.84mg/L，设阴性对照组。37℃，180r/min于摇床中培养7d，每24h取一次样，通过Beacon公司生产的微囊藻毒素检测试剂盒检测藻毒素含量变化。检测方法：吸取50μl酶标记物到微孔板的小孔中；吸取50μl标样、样品、阴性对照到对应微孔中；在各空加入50μl抗体溶液，薄膜快速振荡孵育30min；清洗液清洗微孔5次，将孔里水拍干，加100μl底物，孵育30min；加
100μl停止液，通过酶标仪(SP—Max2300A)在450nm下读板，并绘制标准曲线计算微囊藻毒素浓度。
[0063] 菌株藻毒素降解结果如图5所示，菌株R1从第1天就开始降解藻毒素，到第7天，降解率为43.5％。在含有0.1mg/LCd2+存在的情况下，对降解效率有影响，但影响不大，7天仍能降解40.2％。镉存在并不影响R1降解藻毒素，可能是因为降解藻毒素是组织内某些酶起作用，镉离子并不影响这些酶活性。
[0064] 实施例4
[0065] 溶藻机理探索
[0066] 在无菌操作下，按照5％接入量，分别将牛肉膏蛋白胨液体培养基(对照组)、 R1菌液、重悬的R1菌体(将R1菌液经10000r/min离心15min沉降后清洗三次菌体，使用0.9％的生理盐水制成菌悬液、过0.22μm滤膜的菌液、121℃高温加热的菌液和超声破碎的菌液，分别接入铜绿微囊藻藻液中，每天观察藻细胞形态变化和测定藻细胞叶绿素a的含量。结果如图6所示，从图6可以看出只有重悬的R1菌体失去了溶藻效果，其他处理方式仍具有很强的溶藻效果。
[0067] Molish反应：分别在试管中加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液1mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀；沿管壁缓缓加入1mL浓硫酸，切勿摇动，观察两层液面交界处的颜色变化。然后分别用R1发酵液(含菌体)以及上清液代替糖溶液，做三组同样的实验，观察结果。Molish反应显示，R1发酵液上清中无糖类物质。所述R1发酵液的制备方法为将一环R1菌株接种到200mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180r/min、37℃培养30h得到R1菌液，其在620nm 下，吸光度值为1.0；上清液的制备方法为：5000rmp离心发酵液，去除沉淀，发酵液过0.22um的微孔滤膜，得R1上清液。
[0068] 乙醇沉淀：取R1发酵上清液(上清液)10mL，用30mL无水乙醇沉淀，静置10min，3500r/min离心10min，以上步骤重复三次，合并三次的上清和沉淀。合并后的上清于65℃经旋转蒸发仪处理后，用灭菌的BG11定容至10mL 并称之为溶解相；合并后的沉淀用10mL的BG11溶解并称之为沉淀相。对铜绿微囊藻的溶藻效果如图7所示，R1上清液经无水乙醇沉淀后，有极少量的沉淀，将沉淀溶解后并不具备溶藻能力，而溶解相和R1发酵上清液都显示出了一定的溶藻活性，说明R1的溶藻物质并不是易于在乙醇中沉淀的蛋白质、核酸、多糖类等物质。
[0069] 氨基酸对比：利用氨基酸分析仪(依利特AAK)比较牛肉膏蛋白胨培养基和R1上清液的游离氨基酸含量对比。如图8和9所示，由图8、9可知，对比 R1发酵液上清和液体培养基的游离氨基酸种类差异，发现R1发酵液中多了丙氨酸和苯丙氨酸两种氨基酸。
[0070] 苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、R1发酵液上清溶藻活性比较：分别配置 0.1g/L的Phe、Ala溶液，实验组1为R1发酵液的上清按5％的接种量接入铜绿微囊藻液中光照培养；实验组2为0.1g/L Ala按5％的接种量接入铜绿微囊藻液中光照培养；实验组3为0.1g/L Phe按5％的接种量接入铜绿微囊藻液中光照培养；实验组4为Phe和Ala按1:1的比例混合，按5％的接种量接入铜绿微囊藻液中光照培养。对比五组实验数据，如图10可知，单独添加苯丙氨酸有溶藻效果，但同时添加丙氨酸和苯丙氨酸溶藻效果更显著，推测溶藻物质可能是丙氨酸和苯丙氨酸协同作用的结果。
[0071] 上述参照实施例对一种气单胞菌属菌株R1及制备方法及其在溶藻降解微囊藻毒素上的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
