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一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂   0    0

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专利申请流程有哪些步骤?
专利申请流程图
申请
申请号:指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。
申请日:提出专利申请之日。
2017-12-27
申请公布
申请公布指发明专利申请经初步审查合格后,自申请日(或优先权日)起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。
申请公布号:专利申请过程中,在尚未取得专利授权之前,国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。
申请公布日:申请公开的日期,即在专利公报上予以公开的日期。
2018-06-26
授权
授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由,授予发明专利权;或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由,授予实用新型专利权或外观设计专利权。
2019-11-05
预估到期
发明专利权的期限为二十年,实用新型专利权期限为十年,外观设计专利权期限为十五年,均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。
2037-12-27
基本信息
有效性 有效专利 专利类型 发明专利
申请号 CN201711444378.0 申请日 2017-12-27
公开/公告号 CN108102930B 公开/公告日 2019-11-05
授权日 2019-11-05 预估到期日 2037-12-27
申请年 2017年 公开/公告年 2019年
缴费截止日
分类号 C12N1/14A01N63/04A01P13/00C12R1/645 主分类号 C12N1/14
是否联合申请 独立申请 文献类型号 B
独权数量 1 从权数量 9
权利要求数量 10 非专利引证数量 1
引用专利数量 5 被引证专利数量 0
非专利引证 1、参见全文. 朱云枝,等.马唐生防真菌弯孢霉(Curvularia sp.)菌株QZ-200的生物学特性研究《.植物病理学报》.2004,第33卷(第6期),524-529页. Jianshu Wang等.Differential geneexpression for curvularia eragrostidispathogenic incidence in crabgrass(Digitaria sanguinalis) revealed by cDNA-AFLP analysis《.PLOS ONE》.2013,第8卷(第10期),e75430.;
引用专利 US5952264A、US5635444A、CN101712933A、CN1994092A、CN101856036A 被引证专利
专利权维持 5 专利申请国编码 CN
专利事件 事务标签 公开、实质审查、授权
申请人信息
申请人 第一申请人
专利权人 湖南农业大学 当前专利权人 湖南农业大学
发明人 柏连阳、罗坤、杜桂萍、刘开林、周小毛、刘祥英、胡利锋、刘敏 第一发明人 柏连阳
地址 湖南省长沙市芙蓉区农大路1号 邮编 410128
申请人数量 1 发明人数量 8
申请人所在省 湖南省 申请人所在市 湖南省长沙市
代理人信息
代理机构
专利代理机构是经省专利管理局审核,国家知识产权局批准设立,可以接受委托人的委托,在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。
长沙朕扬知识产权代理事务所 代理人
专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务,取得一定资格的人。
杨斌
摘要
本发明提供一种间型弯孢菌菌株及其应用,所述间型弯孢菌菌株命名为mt‑3,其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13376。本发明的间型弯孢菌,可用作玉米和棉花等作物田间的微生物除草剂制备。本发明还提供了一种除草剂,该除草剂成分简单,环境友好,施用简单,杀草谱广,在对玉米和棉花等作物无害的前提下,对马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等杂草的防治效果达到了75%以上,除草效果见效快,是一种可长期投入使用的生物除草剂。
  • 摘要附图
    一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂
  • 说明书附图:图1
    一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂
  • 说明书附图:图2
    一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂
法律状态
序号 法律状态公告日 法律状态 法律状态信息
1 2019-11-05 授权
2 2018-06-26 实质审查的生效 IPC(主分类): C12N 1/14 专利申请号: 201711444378.0 申请日: 2017.12.27
3 2018-06-01 公开
权利要求
权利要求书是申请文件最核心的部分,是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。
1.一种间型弯孢菌菌株,其特征在于,所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为间型弯孢菌mt-3,其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13376。

2.一种如权利要求1所述的间型弯孢菌在制备除草剂中的应用,其特征在于,包括以下步骤:利用间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后进行震荡培养,真空抽滤培养液,经微孔滤膜过滤后得到包含间型弯孢孢子的发酵液,再利用发酵液或发酵液中的间型弯孢孢子制备所述的除草剂。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d。

4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。

5.一种除草剂,其特征在于,剂型为水剂,主要由权利要求1所述间型弯孢菌的发酵液组成,所述发酵液中含有间型弯孢孢子。

6.根据权利要求5所述的除草剂,其特征在于,所述除草剂包括质量分数的发酵液95-
99%和吐温80 1-5%,所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。

7.根据权利要求5或6所述的除草剂,其特征在于,所述发酵液由间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤后制得;所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d。

8.一种除草剂,其特征在于,剂型为可湿性粉剂,主要由权利要求1所述间型弯孢菌的间型弯孢孢子组成。

9.根据权利要求8所述的除草剂,其特征在于,所述除草剂包括以下质量分数的各组分:间型弯孢孢子70%、崩悬剂DK8 3%、润湿剂1%、白炭黑3%和高岭土23%。

10.根据权利要求8或9所述的除草剂,其特征在于,所述间型弯孢孢子由间型弯孢菌接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤得到发酵液,然后从发酵液中分离得到;所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d。
说明书

技术领域

[0001] 本发明属于微生物工程和除草技术领域,尤其涉及一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂。

背景技术

[0002] 马唐(Digitaria sanguinalis)是世界公认的18种恶性杂草之一,主要危害棉花、玉米、高粱、大豆、烟草、花生等作物,在果园、蔬菜、草坪和园艺作物田中也常有发生。马唐广泛分布于世界热带和温带地区,具有很强的繁殖能力和抗逆性,生长速度快且生长周期长。对马唐的防除主要依赖化学方法,但化学除草剂的长期大量使用将造成环境污染和残毒药害,还会导致杂草抗药性的产生。因此,亟需探寻针对马唐以及抗药性马唐的非化学防除方法。
[0003] 生物除草剂具备对目标杂草致病性强的特点,同时对环境安全,其研究与开发愈来愈受到重视。目前,全球已经成功商业化或正式获得登记的生物除草剂产品有Biochon、StumpOut、Camperico、双丙氨膦钠和Myco-Tech Paste等20余个品种。其中在马唐研究方面,中隔弯孢霉(Curvularia intermedia)菌株被筛选出具有较强的致病力,已申请了专利;黑粉菌(Ustilago syntherismae)也被报道防除效果良好;另外我国有报道分离到画眉草弯孢霉(Curvularia eragrostidis)具有发展成为防除马唐的真菌除草剂的潜力。然而这些菌株杀草谱不够广泛,发酵工艺复杂,不利于推广应用。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是,克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种克服马唐抗药性的间型弯孢菌,具体为一种间型弯孢菌菌株及其应用和除草剂。
[0005] 为解决上述技术问题,从湖南地区棉花田自然发病的马唐中分离、筛选得到1株具有强致病力的菌株,从形态学和分子生物学方面对其进行了鉴定,同时对其生物防治效果和作物安全性进行了评估,旨在为马唐真菌除草剂的研发提供依据,解决湖南棉田马唐的抗药性问题。本发明提出的技术方案为提供一种间型弯孢菌菌株,所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3,其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0006] 本发明的间型弯孢菌,是一种马唐致病菌,寄主范围广,寄主范围包括马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等,对玉米和棉花等作物无害,可用作玉米和棉花等作物田间的微生物除草剂制备。间型弯孢菌(Curvularia intermedia)mt-3与背景技术提到的这些菌株比较,杀草谱更广泛,对马唐、牛筋草、旱稗、马齿苋等杂草均有防治效果,适合用于棉花田除草;另外,具有发酵工艺简单,制剂配方成熟,有推广应用前景。
[0007] 上述的间型弯孢菌菌株的分离方法,包括如下步骤:
[0008] (1)从马唐自然发病的叶片病健交界处剪取组织块,于质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中进行表面消毒3min,用无菌水冲洗3次;
[0009] (2)将所述步骤(1)冲洗后得到的组织块置于PDA培养基上进行恒温培养,恒温培养的温度为28℃;
[0010] (3)待所述步骤(2)恒温培养长出菌落后,从菌落边缘挑取菌丝,移入新的PDA培养基上培养,经过分离纯化得到所述的间型弯孢菌菌株。
[0011] 基于一个总的技术构思,本发明还提供一种上述间型弯孢菌mt-3在制备除草剂中的应用,包括以下步骤:利用间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液(酵母浸出粉胨葡萄糖培养液)后进行震荡培养,真空抽滤培养液,经微孔滤膜过滤后得到包含间型弯孢孢子的发酵液,再利用发酵液或发酵液中的间型弯孢孢子制备所述的除草剂。
[0012] 上述的应用,优选的,所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d;
[0013] 更优选的,所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。
[0014] 一种除草剂,剂型为水剂,主要由所述间型弯孢菌mt-3的发酵液组成,所述发酵液中含有间型弯孢孢子。
[0015] 优选的,所述水剂的除草剂包括质量分数的发酵液95-99%和吐温80 1-5%,所述发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。
[0016] 更优选的,所述发酵液由间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤后制得;所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d。
[0017] 一种除草剂,剂型为可湿性粉剂,主要由所述间型弯孢菌mt-3的间型弯孢孢子组成。
[0018] 优选的,所述可湿性粉剂的除草剂包括以下质量分数的各组分:间型弯孢孢子70%、崩悬剂DK8 3%、润湿剂1%、白炭黑3%和高岭土23%。
[0019] 更优选的,所述间型弯孢孢子由间型弯孢菌mt-3接种于PD培养液后经震荡培养、真空抽滤及微孔滤膜过滤得到发酵液,然后从发酵液中分离得到;所述震荡培养的温度为28℃,震荡培养的转速为150r/min,震荡培养的时间为7d。
[0020] 本发明的除草剂,成分简单,环境友好,施用简单,杀草谱广,在对玉米和棉花等作物无害的前提下,对马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、旱稗、鳢肠和马齿苋等杂草的防治效果达到了75%以上,除草效果见效快,是一种可长期投入使用的生物除草剂。
[0021] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:
[0022] 1、本发明的间型弯孢菌,命名为间型弯孢菌mt-3,是一种马唐致病菌,寄主范围广,寄主范围包括马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等,对玉米和棉花等作物无害,可用作玉米和棉花等作物田间的微生物除草剂制备。
[0023] 2、本发明的除草剂,成分简单,环境友好,施用简单,杀草谱广,在对玉米和棉花等作物无害的前提下,对马唐、牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋等杂草的防治效果达到了75%以上,除草效果见效快,是一种可长期投入使用的生物除草剂。
[0024] 生物材料保藏情况说明:
[0025] 一种间型弯孢菌菌株,所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3,其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,该保藏机构的简称为CGMCC,该保藏机构的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO.13376。

实施方案

[0029] 为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0030] 除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0031] 除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0032] 实施例:
[0033] 一种间型弯孢菌菌株,所述间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株命名为mt-3,其于2016年12月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,该保藏机构的简称为CGMCC,该保藏机构的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0034] 1.病原真菌的分离
[0035] 采集湖南棉田马唐自然发病的叶片,记录植株发病症状。从病健交界处剪取组织块,于0.1%的升汞溶液中表面消毒3分钟,无菌水冲洗3次,置于PDA培养基上,28℃恒温培养,待长出菌落后,从菌落边缘挑取部分菌丝,移入新的PDA平板上培养,经过分离纯化得到一种间型弯孢菌(Curvularia intermedia)菌株,命名为mt-3,其于2016年12月23日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13376。
[0036] 2.菌株mt-3的致病性测定
[0037] 采用离体法测定菌株mt-3对马唐叶片的致病性。用打孔器打取已培养7d的菌落菌丝块,接种至PD培养液(100mL/瓶),每瓶接种3块直径为9毫米的菌丝块,28℃、150r/min振荡培养。7d后真空抽滤培养液,再用微孔滤膜过滤,获得发酵液。用微型喷雾器喷洒接种至1叶1心~2叶期的马唐植株上(Treantment),接种量20mL/盆。以无菌PDA培养液为对照(CK),每处理重复3次。接种后3d叶片上出现轻微病变,菌丝块长出大量菌丝,逐渐向叶片周围侵染,叶片开始变黄,5d后叶片出现褐色斑点,并逐渐扩大,叶片变黑腐烂(图1)。整株喷施菌株发酵液后2d,抗性马唐植株表现出病变症状,叶片变黄褪绿,5d后逐渐萎蔫,最终整株呈枯萎死亡状(图2)。
[0038] 为了进一步测定菌株mt-3对不同生育期马唐的致病性,我们采用菌丝块接种法,分别于马唐的1叶1心~2叶、3叶~3叶1心和4叶1心~5叶期进行接种。每处理1盆,每盆保留10株生长一致的马唐。如表1所示,菌丝体发酵液接种不同生育期的马唐植株后5d,1叶1心~2叶、3叶~3叶1心和4叶1心~5叶期的抗性马唐植株的发病率高达100%、95%和
88.33%,平均鲜重防效分别达到了82.78%、79.24%和63.37%,其中1叶1心~2叶期的马唐对菌丝体发酵液最敏感。
[0039] 表1菌株mt-3对不同生育期马唐的致病性
[0040]
[0041] 注:表中数值为平均值±标准误,同列数据后的不同字母表示在0.05水平上差异显著。
[0042] 3.菌株mt-3的寄主范围测定
[0043] 除了马唐之外,我们还准备供试杂草牛筋草、千金子、狗尾草、鳢肠和马齿苋,与棉花和玉米种苗一起同时处理,在三叶一心期,利用mt-3发酵液进行喷雾处理,保湿48小时,以未施用mt-3发酵液的植物作为对照,调查施用mt-3发酵液的植物的发病情况。结果如表2所示,菌株mt-3对供试作物棉花表现为无症状(NS),对供试杂草牛筋草、千金子和狗尾草表现为中等感病(MS),在接种植株上端叶片出现病斑,后期株高和长势受到抑制,对鳢肠和马齿苋表现为轻微反应(LS),叶片上产生少量较小的病斑。
[0044] 表2菌株mt-3的寄主范围测定
[0045]
[0046] 4.菌株mt-3的防治效果测定
[0047] 以异丙甲草胺乳油为对照药剂,在2016年汉寿县棉花田进行田间试验,菌株mt-3发酵好后,棉花苗移栽7天后,用菌株mt-3发酵液,发酵液的制备方法同上,发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克。菌株mt-3发酵液的浓度为每亩500、600、800、1200ml,选用异丙甲草胺作对照药剂,结果如表3所示,结果表明对总草的防治效果达到75%以上,尤其对马齿苋和牛筋草的防治效果达到80%以上,对旱稗的防治效果最高也达到了83%,与对照药剂和人工除草的防治效果相当,真正实现杂草的环境无害化生物防治。
[0048] 表3菌株mt-3的防治效果测定
[0049]
[0050]
[0051] 可以将发酵液与吐温80混配按质量分数发酵液95-99%和吐温80 1-5%的配比制成除草剂,发酵液中含有20-1000亿间型弯孢孢子/克;也可以将发酵液中的间型弯孢孢子分离出来,按质量份数间型弯孢孢子70%、崩悬剂DK8 3%、润湿剂1%、白炭黑3%和高岭土23%的配比制成除草剂,发酵液的制备方法同上。用除草剂对移栽7天后的棉花苗进行喷施,对杂草的防治效果均在75%以上。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027] 图1是实施例中马唐植株上接种菌株发酵液和无菌PDA培养液的致病性测定对比图。
[0028] 图2是实施例中马唐整株喷施菌株发酵液和无菌PDA培养液的致病性测定对比图。
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