一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途   0    0

本发明公开了一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途，该降压肽的氨基酸序列为Leu‑Arg‑Pro‑Ile（SEQ ID No：1），ESI‑MS检测给出分子量为497.65 Da（[M+H]+ 498.48 Da）。制备时蒸馏水洗净大黄鱼鱼鳔，用高速组织捣碎机匀浆，用Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液抽提，硫酸铵分级沉淀得粗蛋白；粗蛋白经胰蛋白酶和碱性蛋白酶依次酶解，酶解物经离心、超滤和色谱精制，得到降压肽。本发明降压肽的制备工艺科学合理，双酶酶解过程易于控制，制备的降压肽对血管紧张素转化酶（ACE）具有显著的抑制作用，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药物和保健食品。

1.一种大黄鱼鱼鳔蛋白降压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼鳔洗净、破碎匀浆，按料液比1g:8～10 ml的比例加入浓度0.2mol/L，pH 
7.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，于 0～4 ℃下振荡抽提24～48 h，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，得上清液；上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到30%，静置1～3 h后，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，去除沉淀物，上清液中继续加入硫酸铵，使其浓度达到60%，静置1～3 h后，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，得沉淀物，并置于透析袋中用蒸馏水透析18～24 h，透析液冷冻干燥，得鱼鳔粗蛋白；
2）取鱼鳔粗蛋白，按照料液比1 g:15 20 mL加入双蒸水，调节pH 值至7.5 8.0，于35~ ~ ~
40℃保温10 15 min；按照鱼鳔湿重的1.0 1.5%加入第一种蛋白酶，于35 40℃温度下酶解3~ ~ ~
5 h；酶解液调pH 值至9.0 10.0，于40 50℃保温10 15 min；按照鱼鳔湿重的1.0 1.5%加~ ~ ~ ~ ~
入第二种蛋白酶，于40 50℃温度下酶解2 4 h；
~ ~
3）将酶解液加热到90 95℃灭活10 15 min，4500 5000 rpm离心15 20 min，取上清液；
~ ~ ~ ~
上清液依次经超滤和层析，得到降压肽；该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1），分子量为497.65 Da；
所述步骤2）中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥1.85×105 U/g；
所述步骤2）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.90×105 U/g。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5 7.5，于0.10   0.15 MPa的工作压力和25 30℃的工作温~ ~ ~
度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；
层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成10 15 mg/mL的溶液，经过大孔树脂分离，用双~
蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱，分别收集相应梯度的洗脱溶液，干燥，得四个组分，其中，ACE抑制活最强组分为大孔树脂纯化酶解物；将上述大孔树脂酶解物用双蒸水配成10 15 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm~
下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80 100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据ACE~
抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为DA 201-C，所述凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex LH-20；所述RP-HPLC条件为：进样量15 20 μL；色谱柱为Waters ~
Spherisorb ODS-2 C18；柱温为25 30 ℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水和B乙腈；梯度洗~
脱：0 10 min乙腈浓度为10%；11 40 min乙腈浓度从10匀速升至60%；洗脱速度0.8 1.0 mL/~ ~ ~
min；紫外检测波长220 nm。

4.一种权利要求1中所述的大黄鱼鱼鳔降压肽的应用，其特征在于Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）用于制备保健食品的用途。