[0004] 本发明涉及培养间充质干细胞的方法，该间充质干细胞能够同时高度表达TGF‑1、GM‑CSF和VEGF等伤口愈合相关因子；更一进步地，本发明涉及富含细胞因子的外泌体制剂，该外泌体制剂收集源自上述间充质干细胞培养液的培养上清；更进一步地，本发明涉及该外泌体制备促进皮肤修复、创伤愈合药物的用途。
[0005] 具体而言，本发明的一个方面提供了培养高度表达细胞因子的间充质干细胞群的方法，第一种培养方法，包括：在低氧的条件下培养干细胞。已知低氧条件不会影响干细胞的表型及干性，并可促进干细胞增殖、分化、迁徙、抗凋亡及对缺血缺氧的耐受，但在申请日前，仍然不知低氧条件对间充质干细胞分泌伤口愈合相关因子效应的影响如何。根据本发明，低氧条件可通过低氧装置控制实现，在低氧条件下，氧气的浓度可以为1～3％，最好是1％、2％或3％。
[0006] 在本发明具有代表性的实施例中，用于在低氧条件下培养间充质干细胞的培养基中可以包括加入或者未加入胎牛血清的基础培养基；基础培养基的例子包括DMEM、MEM或DMEM/F12；根据需要还可含有氨基酸、维生素、抗生素等活性成分。
[0007] 氨基酸的例子包括：L‑谷氨酰胺、L‑组氨酸、L‑异亮氨酸、L‑亮氨酸、L‑赖氨酸、L‑蛋氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑缬氨酸等。在本发明的实施例中最好使用L‑谷氨酰胺，L‑谷氨酰胺的浓度通常介乎1～3mmol/L之间，例如2mmol/L。
[0008] 维生素的例子包括：抗坏血酸或其衍生物，如抗坏血酸磷酸酯镁；在本发明的实施例中最好使用抗坏血酸，在培养基中，抗坏血酸的浓度通常介乎1～5mg/ml之间，例如约2mg/ml。
[0009] 抗生素的例子包括链霉素和/或青霉素，当含有抗生素时，可以不包含其他添加剂成分，在本发明的实施例中最好使用链霉素和青霉素，青霉素的浓度通常介乎50～120U/ml之间，例如100U/ml。链霉素的浓度通常介乎于50～120μg/ml，例如100μg/ml。
[0010] 本发明表1显示了2％O2、3％O2和常氧条件下培养的人脐带间充质干细胞细胞因子分泌情况，从结果可看出，低氧条件培养相关因子的表达量均比常氧条件下要高，特别是IL‑6、IL‑8和MCP‑1表达量与常氧相比显著增加(P＜0.05)；但是GM‑CSF和VEGF因子无论是在低氧或者常氧条件下的表达量均较低。
[0011] 本发明另一方面提供了培养高度表达细胞因子的间充质干细胞群的第二种方法，包括：在含双氢青蒿素的培养基中培养干细胞；在申请日之前，尚未报道双氢青蒿素用于干细胞的培养，并刺激其高度表达相关细胞因子的例子。
[0012] 特别的，在培养基中，双氢青蒿素的浓度通常介乎1～10μmol/L之间，例如3μmol/L、5μmol/L或6μmol/L。
[0013] 特别的，在本发明具有代表性的实施例中，含有双氢青蒿素的培养基还可以进一步包含适量的基础培养基和2‑巯基乙醇。基础培养基的例子包括DMEM、MEM或DMEM/F12，在本发明的实施例中最好使用DMEM基础培养基。
[0014] 在本发明具有代表性的实施例中，2‑巯基乙醇的存在是必要的，在培养基中，2‑巯基乙醇的浓度通常介乎1～5μl之间，例如2μl或3μl。
[0015] 特别的，可以不包含胎牛血清或者其他添加剂组分，如氨基酸、维生素、抗生素等。
[0016] 本文中所述“干细胞”是指具有分化潜能和自我更新能力的细胞(全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞)，在本发明中特指间充质干细胞，更具体的是特指脐带间充质干细胞，在本文中已经验证了第一和第二培养方法均能够刺激人脐带间充质干细胞高度表达白细胞介素因子、MCP‑1、TIMP‑1、GM‑CSF等相关伤口愈合因子，这种效应有可能在其他间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞的身上同样可观察到，但还有待进一步研究验证。
[0017] 特别的，本发明第一培养方法和第二培养方法可以单独执行或者组合或者同时执行。在本发明具有代表性的实施例中，第一培养方法和第二培养方法同时执行，将在获得的间充质干细胞身上观察极强的细胞因子分泌效应，特别是第一培养方法中低表达的GM‑CSF和VEGF观察到强的分泌效应。
[0018] 本发明表3显示了第一培养方法和第二培养方法同时执行培养的间充质干细胞相关因子的表达情况，通过比较加入或者未加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌细胞因子的情况，结果显示，2％O2下，加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞同时高度表达IL‑6、IL‑8、TGF‑1、MCP‑1、VEGF、TIMP‑1和GM‑CSF，特别是常氧或低氧下低表达或者是不表达的VEGF和GM‑CSF因子；经双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌的VEGF和GM‑CS细胞因子量更高。
[0019] 本发明另一方面提供一种外泌体制剂，该外泌体制剂收集源自第一培养方法和第二培养方法单独执行或者组合或者同时执行培养的间充质干细胞培养液的培养上清。已然通过试验证明，该培养上清中富含白细胞介素因子、MCP‑1、TIMP‑1、GM‑CSF等相关伤口愈合因子，这些因子对于促进皮肤的修复、创面的愈合、上皮组织的形成是非常有利的。
[0020] 本发明另一方面提供了富含细胞因子的外泌体制剂在制备促进皮肤修复、创伤愈合药物中的用途。这些药物可用于创伤、烧伤和溃疡愈合的临床治疗。
[0021] 小鼠创面愈合试验显示，在不同的时间点，经注射第一培养方法和第二培养方法同时执行培养的间充质干细胞培养液上清的小鼠创面残余面积均显著低于其他组，创面愈合速率明显较其他组快，第7天可观察到新生肉芽，第14天时基本完成上皮化。
