[0027] 所用材料与试剂：所试刺葡萄采自湖南省怀化市中方县，刺葡萄类型为“湘珍珠”；采用胶体磨碾磨刺葡萄整个果实获得刺葡萄浊汁备用。试剂包括色谱纯乙腈，正丁醇，甲醇，甲基叔丁基醚，三氟乙酸等(天津恒兴化学试剂公司)。
[0028] 所用仪器设备：TBE‑300A型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)；MODULYOD‑230冷冻干燥机(美国热电公司)；LC‑20AT高效液相色谱(日本岛津公司)；核磁共振器(美国瓦里公司)。另外仪器还涉及超声波清洗仪；HH数显恒温水浴锅；超过滤装置等。
[0029] 方法步骤：
[0030] (1)刺葡萄汁中化学成分的HPLC分析
[0031] 高效液相色谱(HPLC)参数：Science WondasilTM C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A：0.2％磷酸水，B：乙腈。洗脱程序：0‑30min：8→30％B；流速1mL/min，柱温30℃。二极管阵列检测器，检测波长530nm。
[0032] 花色苷具有独特的吸收特征，在可见光区和紫外区的最大吸收波长分别为530nm和280nm附近，通过光谱特征可对花色苷进行简单定性。通过HPLC色谱分析，发现刺葡萄汁中主要含有两种花色苷，保留时间分别为15.42min(花色苷1)和27.81min(花色苷2)，还有一些色谱峰较小的物质(图1)。花色苷及主要色谱峰紫外光谱见图2，图2A和B分别表示花色苷1和2。一些非花色苷成分多在280nm左右有强吸收，符合多酚类化合物的紫外吸收光谱，推测这些为其他多酚类物质。
[0033] (2)高速逆流色谱进样原料的制备
[0034] 制备参数：取刺葡萄汁3L，5000r/min转速离心10分钟，取上清液用盐酸调节pH 2‑3，以2‑2BV/h的流速通过装有AB‑8大孔吸附树脂的层析柱(60cm×3cm，树脂350mL)，待树脂吸附完成后，关闭阀门静轩半个小时。然后用蒸馏水快速洗柱，至流出的水颜色很浅，再用
70％乙醇以3‑4BV/h的流速洗柱，接收流出来的红紫色液体。将流出液，利用冷冻干燥机，于‑50℃减压浓缩冷冻干燥，制得干粉3.3g(1.1g/L)，冷藏保存备用，作为HSCCC的进样原料。
[0035] 对进样原料除去大量的蛋白质、多糖等物质对提高后续花色苷的分离效果有极大帮助。本发明采用AB‑8大孔吸附树脂对刺葡萄汁中的化学成分进行富集，蛋白质、多糖等成分与大孔吸附树脂没有亲和力的物质不会被树脂吸附，上样时会直接流出；而花色苷、多酚等成分会被树脂吸附，并经乙醇的洗脱，与杂质分离，各组分经冷冻干燥处理后含量均有大幅度提升，这对于后续的分离有利。
[0036] (3)高速逆流色谱花色苷分离体系的筛选
[0037] 高速逆流色谱中分离花色苷的经典溶剂体系主要由水、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈及少量三氟乙酸组成。在本研究中多个不同比例的溶剂体系被选择(表1)。各溶剂按照比例配制后，震摇后静置自然分层。取3ml下相溶液，加入少量冷冻干燥干粉，利用超声进行溶解后再取样，加入等体积的上相溶液萃取。
[0038] 通过HPLC分别测定萃取前后样品中的目标组分在下相溶液中的萃取面积，分别记为S萃前和S萃后，按如下计算各成分的分配系数K值。K＝(S萃前‑S萃后)/S萃前。根据计算出来的不同组分K值，通过比较，计算出分离度(分离度＝K2/K1)。分离度越大表示量组分分离效果越好，由此选出适宜的溶剂体系作为HSCCC的流动相与固定相。
[0039] 本发明试验的K值见表1。由表可见，溶剂体系1、3、4中两个花色苷的K值均偏小，在固定相中保留时间短而难以分离。溶剂体系2、5中两个花色苷的K值均有较大提高，测定的分离度﹥1.5，经过上样机器分离发现，目标组分在两种溶剂体系中分离效果相差小，可以获得高纯度的花色苷1和花色苷2。由于体系5中有机溶剂的比例小于体系2，因此可选定体系5作为分离花色苷体系。
[0040] 表1不同溶剂体系K值表
[0041]
[0042] (4)刺葡萄花色苷高速逆流色谱分离
[0043] 按步骤(3)中所确定的溶剂体系5，即水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：三氟乙酸(v/v，5：3：1：1：0.001)配制1L，静置过夜后两相分离，经30min超声脱气。上相作固定相，下相作流动相。取步骤2中制备的干粉200mg和250mg用20mL下相(流动相)进行溶解。将固定相以20mL/min的流速泵满管路，再以850rpm/min正转，流速2mL/min的条件泵入流动相；温度设置为25℃，检测波长280nm。有流动相流出时体系平衡。平衡后，停泵，用注射器进进样20mL，开泵，同时检测器开始记录。根据HSCCC图谱分别收集98‑114min和210‑220min的流出液。按上述HSCCC参数，测得固定相的保留率可达69％。根据色谱流出图对组分出峰部位进行分步收集、检测，获得高纯度的花色苷1和花色苷2。
[0044] 本发明，试验了两个粗提物上样量，发现上样量对分离效果影响较大(图3)，上样量为250mg时(图3A)花色苷1与前面杂质峰未能分离，上样量选择200mg时花色苷1与杂质峰能分离开(图3B)。所以采用200mg上样。回收后的两组流出液，冷冻干燥分别得到干燥样本23.3mg和15.4mg，回收得率分别为11.65％和7.7％。
[0045] (5)刺葡萄花色苷1、2纯度测定
[0046] 取一定量步骤4制得的花色苷干粉用甲醇溶解后，采用HPLC进行检测(图4)，根据280nm处的色谱图按面积归一法计算得到花色苷1和花色苷2的纯度分别为95.8％和
92.2％，计算得出从原刺葡萄浊汁中制备这两个花色苷产率分别为122.77mg/L和78.09mg/L。
[0047] (6)刺葡萄花色苷的结构鉴定
[0048] 采用HPLC‑MS、1H NMR和13C NMR对两个花色苷进行结构鉴定。质谱采用电喷雾电离源(ESI)，花色苷1、2采用正离子模式，由湖南农业大学分析测试中心完成；采用核磁共振测定的花色苷用重水溶解，频率为500MHz，由湖南大学化工院分析测试中心完成。结构鉴定结果显示：
[0049] 花色苷1：为紫红色粉末，在280nm和520nm处有特征吸收，故该化合物为花色苷类化合物；LC‑MS(ESI，positive)离子峰m/z为655.1859，由于花色苷以正离子形式存在，测得的分子离子峰即为花色苷的分子量。质谱中还有其他离子碎片，主要碎片离子峰有：m/z＝493.1328(可能为花色苷失去1分子葡萄糖)，331.0808(可能为花色苷失去2分子葡萄糖)；
核磁共振分析结果为：1H NMR(500MHz，δ)：8.04(1H,H‑2’,s),7.48(1H,H‑6’,s),7.00(2H,H‑2”’,H‑6”’,s),6.83(1H,H‑8,d,2.0Hz),6.45(2H,H‑3”’,H‑5”’,m),6.31(1H,H‑6,m),
6.13(1H,H‑1”’,d,1.5Hz),4.96(1H,H‑1”,s),3.72(1H,H‑1”,s),3.56(3H,OCH3,s),3.50(3H,OCH3,m)；确定花色苷1为：锦葵素‑[3‑O‑葡萄糖‑]‑[5‑O‑葡萄糖]，分子式为C29H35O17。
结构式见(图6)。
[0050] 花色苷2：为紫红色粉末，在280nm和520nm处有特征吸收，故该化合物为花色苷类化合物；LC‑MS(ESI，positive)离子峰m/z为801.2239，由于花色苷以正离子形式存在，测得的分子离子峰即为花色苷的分子量，质谱中可见其他离子碎片：m/z＝493.1328(可能为花色苷2失去1分子葡萄糖和香豆酸)，331.0806(可能为花色苷2失去2分子葡萄糖和香豆酸)。核磁共振分析结果为：1H NMR(500MHz，δ)：8.57(1H,H‑4,s),7.58(1H,H‑2’,d,1.5Hz),7.55(1H,H‑6’,d,1.5Hz),7.35(1H,CH＝CH‑,t,7.6Hz),7.27(2H,H‑2”’,H‑6”’,s),6.86(1H,H‑
8,d,2.0Hz),6.77(2H,H‑3”’,H‑5”’,m),6.42(1H,H‑6,m),6.12(1H,CH＝CH‑,d,7.6Hz),
5.87(1H,H‑1”’,d,7.6Hz),4.85(1H,H‑1”,s),3.82(1H,H‑1”,s),3.76(3H,OCH3,s),3.35(3H,OCH3,m)。确定花色苷2为：锦葵素‑[3‑O‑β‑葡萄糖基‑6‑香豆酰]‑[5‑O‑β‑D‑葡萄糖]，分子式为C38H41O19，结构见(图6)。
[0051] (7)刺葡萄中花色苷含量的测定
[0052] 刺葡萄果皮中含大量花色苷，但由于技术的制约，该资源还未得到更为充分的利用。对刺葡萄色素的进一步研究有望实现此资源的更全面、高效的应用：同时可以推广这一优良品种，改善当地农产品的产业结构，增加农户收入。本发明采用前述制备的花色苷标准品，对刺葡萄中花色苷进行定量检测。
[0053] A标准曲线的绘制
[0054] 供试样准备：刺葡萄果皮：取一串刺葡萄进行手工剥皮，滤干，研磨均匀，精密称取5.0g，用50ml甲醇避光超声提取40min，离心，上清液定容至50ml，膜过滤，进样5μl；刺葡萄果实(浊汁)：取同一批刺葡萄鲜果一串，进行匀浆处理，精密称取2.0g，加入8ml甲醇避光超声提取40min，上清液定容至10ml，膜过滤，进样5μl；刺葡萄果汁(清汁)：通过压榨机压榨，静置后取上清汁，0.45μm尼龙膜过滤，进样20μl。
[0055] 标准品准备：分别称取花色苷1、2标准品适量，用0.2％磷酸水溶解，配制成浓度为1.539mg/mL和1.125mg/mL的储备液，测定时逐级稀释所需浓度，进样量设为20μl。
[0056] (1)稳定性试验：精密吸取同一份混合对照品溶液置棕色瓶中，室温放置，分别在0、1、2、4、6、8h测定,计算RSD。
[0057] (2)重现性试验：精密称取同一份样品3份，按方法制备成供试溶液，进样,计算RSD。
[0058] (3)回收率试验：精密量取已知含量的同一样品3份，分别加入一定量标准品，按方法制成供试液，进样，计算加标回收率。
[0059] 标准曲线的绘制：根据上述分离花色苷的吸收特征，在280nm和530nm均有较强吸收，由于280nm下化合物组成较多，而530nm干扰物质很少，因此检测波长设为530nm。各浓度标准品相应见图7。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，花色苷1的回归方程为2
Y＝253873X‑109745(R＝0.9989)，线性范围0.7695‑9.234μg，最低检出限为0.07695μg；花
2
色苷2的回归方程为Y＝325564‑150957(R ＝0.999)；线性范围：0.5625‑6.75μg，最低检出限为0.05625μg；花色苷化合物质量与峰面积呈良好线性关系。
[0060] (1)稳定性试验结果：花色苷的含量会随放置时间的延长而下降，在4h内RSD小于5％，较为稳定，因此后续实验样品制备后均在4h内进样测定。同时由表2可知花色苷1的稳定性大于花色苷2。
[0061] 表2刺葡萄花色苷稳定性试验结果
[0062]
[0063] (2)重现性试验：同一份样品按方法制备3份供试液的测定结果见表3，花色苷1和花色苷的RSD分别为2.53％和4.98％，RSD＜5％，重现性较好。
[0064] 表3刺葡萄花色苷重现性试验结果
[0065]
[0066] (3)回收率试验：样品加标回收率结果见表4，由表可见，花色苷1的平均回收率为95.19％，花色苷2的平均加收率为94.37％，满足测定要求。
[0067] 表4加标回收率试验结果
[0068]
[0069] B样品中花色苷含量的测定
[0070] 取适量样品进行HPLC分析，根据标准曲线计算样品中花色苷1、2的含量。由表5可见，新鲜刺葡萄皮中花色苷含量平均为11.8067mg/g，果实含量为2.0267mg/g，果汁中0.2294±0.0104mg/ml；花色苷1含量高于花色苷2，约为花色苷2的1.2倍。
[0071] 表5刺葡萄花色苷含量测定
[0072]
