[0051] 本发明提供了一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，包括以下步骤：1)将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾；2)将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水；所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L；所述联合处理的温度为32～42℃；所述联合处理体系的初始pH值为5～8；
所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L；所述联合处理含铬废水的时间≥8h。
[0052] 本发明将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾。本发明对所述李氏禾的来源没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，所述李氏禾优选的采自雁山镇雁山园鱼塘周边和田地，所述李氏禾优选为健康、无污染的李氏禾幼苗。本发明在采集所述李氏禾后，优选的用自来水反复冲洗所述李氏禾幼苗，去掉李氏禾根部淤泥和杂质，然后用超纯水冲洗所述李氏禾。本发明将所述李氏禾幼苗置于培养液中培养12～18d，优选地培养14～16d，更优选地培养15d。在本发明中，所述培养液为1/2的Hoagland营养液，所述培养液中优选的添加
80～120kU/L的青霉素和80～120mg/L的链霉素，更优选地添加100kU/L的青霉素和100mg/L的链霉素。在本发明中，所述1/2的Hoagland营养液的配方优选的见表2。在本发明中，所述李氏禾优选的置于人工气候箱(LRH‑550‑GSI)中进行培养，所述李氏禾的培养过程中的光照周期优选为10～14h/d，更优选为12h/d；所述李氏禾的培养过程中的温度控制优选为：25℃白天/20℃晚上；所述李氏禾的培养过程中的相对湿度优选为70％～80％，更优选为
75％；所述李氏禾的培养过程中的光照强度优选为6500～7500Lx，更优选为7000Lx；所述李氏禾培养过程中，每天早上9:00、晚17:00各加1次超纯水以维持营养液体积恒定，每3d更换
1次培养液，用浓度为0.1mmol/L的NaOH和0.1mmol/L的HCl将营养液的pH控制在5.5±0.3。
[0053] 表2 Hoagland营养液配方
[0054]
[0055] 本发明在对所述李氏禾培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养获得预培养后的李氏禾。所述胁迫培养的时间为8～12d，优选为10d。本发明对加入的六价铬优选为重铬酸钾，所述六价铬的浓度优选为10mg/L。在本发明中向所述培养液中加入六价铬的作用为胁迫李氏禾适应含有六价铬的水体环境。
[0056] 本发明在获得所述预培养后的李氏禾后，将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水。在本发明中，所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L，优选为0.08～0.12g/L，更优选为0.1g/L。在本发明中，所述蜡状芽孢杆菌优选的购自中国典型培养物菌种保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCCAB2011085。在本发明中，所述联合处理的温度为32～42℃，优选为33～37℃；所述联合处理体系的初始pH值为5～8，优选为6～7；所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L，优选为4mg/L；所述联合处理含铬废水的时间≥8h，优选的为8～12h。
[0057] 在本发明中，所述联合处理体系中优选的还包括氮肥、磷肥和钾肥中的一种或几种。在本发明中，所述氮肥优选为(NH4)2SO4、CO(NH2)2或Ca(NO3)2；当所述氮肥为(NH4)2SO4时，所述氮肥(NH4)2SO4在所述联合处理体系中的浓度优选为15～25mg/L，更优选为20mg/L；当所述氮肥为CO(NH2)2时，所述氮肥CO(NH2)2在所述联合处理体系中的浓度优选为55～
65mg/L，更优选为60mg/L；当所述氮肥为Ca(NO3)2时，所述氮肥Ca(NO3)2在所述联合处理体系中的浓度优选为55～65mg/L，更优选为60mg/L。在本发明中，所述联合处理体系中添加(NH4)2SO4氮肥对六价铬的还原效果最好。在本发明中，所述磷肥包括(NH4)2HPO4、Ca(H2PO4)2和KH2PO4中的一种或几种。在本发明中，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度优选为8～
12mg/L，更优选为10mg/L；所述磷肥在相对较低的浓度(8～12mg/L)的情况下，对所述联合处理体系的促进效果更好。在本发明中，所述钾肥优选为K2SO4、KCl或K2CO3；在本发明中，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度优选为10～30mg/L。本发明在所述联合处理体系中添加氮肥、磷肥和钾肥能够促进蜡状芽孢杆菌和李氏禾的生长，进而促进联合处理体系对铬的还原。
[0058] 本发明中，李氏禾的植物组织能超富集Cr(VI)和Cr(Ⅲ)使其固定于植物体内，受到外界重金属胁迫时，植物根际分泌物中的烯烃、酸、醇、酚、醛也能够促进还原Cr(VI)，同时，蜡状芽孢杆菌不但能够依靠自身的胞外分泌物还原Cr(VI)，蜡状芽孢杆菌的细胞壁也可以还原Cr(VI)，并固定于自身。根系分泌物会作为根际微生物生长和繁殖过程中重要的碳源、能源物质，对微生物的种类、数量及其在植物根际的分布有巨大影响。
[0059] 本发明中李氏禾与蜡状芽孢杆菌的生长需要适宜的温度、pH、溶解氧范围，这与体系还原Cr(VI)效率密切相关。在适宜的温度环境下，会加快细胞的生物化学反应和生长速率，体系作用加快，对Cr(VI)的还原效率较高。反之，如若持续高温或低温，会对细胞内敏感组成部分(如蛋白质、核酸等)遭受不可逆的破坏，植物会出现萎蔫枯黄或冻伤的迹象，直接影响根系的生长发育，而李氏禾根系又是吸收富集铬的重要途径，因此植物‑微生物体系只有保持在适宜生长的温度范围内，才会提高其修复速率。
[0060] 本发明所用李氏禾采自雁山镇雁山园周边，土壤pH为6.5，偏中性。不同初始pH值对体系作用效果也有所差异，但是溶液的pH值都有偏向于中性环境的趋势，这可能是细菌的代谢活动主要作用引起的环境中pH值迅速改变，其一，溶液中的含氮有机物被微生物降解后产生氨等碱性物质，分解过程产生的有机酸，都会影响pH的改变；再者，细胞选择性吸收离子性物质而引起pH值的改变，例如水培营养液中的硝酸钾作为氮源时，硝酸根被吸收进细胞，会导致pH值增加；而以硝酸铵作为氮源时，铵根离子被吸收，会降低体系pH值，最终调整为适宜细菌生长的中性环境。同时体系中pH值的改变也从另一方面说明了细菌对环境的适应能力。总体来讲，蜡状芽孢杆菌与李氏禾共同作用生长最适pH值为中性，并在该值下可达到较理想的六价铬还原效果。
[0061] 本发明中，所述蜡状芽孢杆菌在有氧气存在的情况下才能进行生长代谢活动，但是在氧气过量的条件下，氧气会作为电子受体与Cr(VI)进行竞争，细菌会在消耗氧气之后，再对Cr(VI)慢慢还原；同时过量的氧气会分解溶液中有机物质，就此降低了整体对Cr(VI)的还原效果。保持根际环境在适宜的溶液氧浓度会提高李氏禾‑蜡状芽孢杆菌体系对Cr(VI)的还原效率，产生一定的积极作用。
[0062] 本发明中的氮、磷、钾肥是植物生长过程中活跃的营养因素，通过施肥的方式可有效改善根际环境养分状况，促进植物对养分的吸收，以达到高产、优产，促进植物生长，提高植株生物量，进而提高植物富集重金属的浓度。
[0063] 通过施加有机肥中化合物和重金属的相互作用，可以影响体系对重金属的吸附解吸，改变介质中的重金属形态，进而改变重金属的活性。水培溶液中添加的氮肥—(NH4)2SO4对六价铬还原作用性最好，可能是硫酸铵中的阴离子起到吸附作用，导致溶液中颗粒表面负电性增加，占据相当数量的表面活性位置所致，同时这些阴离子与金属络合形成可溶性金属—配位体络合物，降低水体对铬离子的吸附，从而影响植物的吸收、累积。
[0064] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0065] 实施例1
[0066] 实验所用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)购自中国典型培养物菌种保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCCAB2011085，菌种形式为冻干粉。
[0067] 试验前期将蜡状芽孢杆菌接种至斜管LB培养基上，待菌株活化复苏后进行扩大培养(控制摇床条件为：30℃、160r/min)，培养12h时锥形瓶中细菌生长浑浊，瓶壁有菌膜，呈淡乳白色，静置沉淀分层，细菌光密度值OD600为0.8，处于对数生长期。接种至第三代，菌种代谢稳定后，进行实验。
[0068] 将扩大培养的蜡状芽孢杆菌，分装在10mL的离心管中，置于高速冷冻离心机8000r/min离心，去掉上层悬浮营养液，蜡状芽孢杆菌在下层沉淀，将离心管管口塞上灭菌棉花，放入冷冻干燥机干燥72h，直到蜡状芽孢杆菌呈冻干粉状，取出放于天平称重，测得扩大培养12h后10mL的菌液中蜡状芽孢杆菌的干重，约为0.1g，则100mL溶液里的细菌溶度约为1g/L。添加扩大培养12h的液体溶液直接投加至李氏禾的营养液中(扩大培养的溶液中存在LB培养基，能维持细菌的生长)。例：取30mL 1g/L的扩培菌溶液加入到总体积300mL的锥形瓶，总溶液细菌浓度为0.1g/L。
[0069] 实验中所用李氏禾幼苗均采自雁山镇雁山园鱼塘周边和田地间，无污染，采集到的李氏禾用自来水反复冲洗，去掉根部淤泥和杂质，后用实验室制备的超纯水冲洗三次，再将李氏禾放入黑色塑料小桶，添加50％强度的改良Hoagland营养液+抗生素(青霉素、链霉素)进行水培培养(具体配方见表2)，每组20～30株李氏禾幼苗，保证根部避光(为防止根系生成藻类物质对实验结果造成影响)，置于人工气候箱(LRH‑550‑GSI)中进行培养，生长条件为：光照周期12h/d；温度控制：25℃白天/20℃晚上；相对湿度75％；光照强度7000Lx，每天早上9:00、晚17:00各加1次超纯水以维持营养液体积恒定，每3d更换1次培养液，用浓度为0.1mmol/L的NaOH和0.1mmol/L的HCl将营养液的pH控制在5.5±0.3，李氏禾幼苗预培养两周时间。
[0070] 李氏禾预培养结束后，添加对数生长期的蜡状芽孢杆菌条件下，Cr(Ⅵ)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度0.1g/L；无菌环境下，添加抗生素为青霉素和链霉素混合液抗菌，从商家购买后100倍稀释分装待用，每500mL培养液里加入5mL青链霉素混合液，用于预防细菌污染，青霉素含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL，直接添加到植物培养液中。
[0071] 最后调整最优环境进行综合实验对比发现，将预培养后的李氏禾移入Cr(VI)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度为0.1g/L的塑料烧杯中，蜡状芽孢杆菌在液体LB培养基中扩大培养至对数生长期，李氏禾根部避光，通过控制实验条件在最佳溶解氧为4.0mg/L、温度为32℃和初始pH＝7.0的实验条件，与空白组相比较可以发现，同一时间情况下，李氏禾‑蜡状芽孢杆菌体系对溶液中六价铬还原率普遍高于空白处理组(如图1所示)，第10h时水中六价铬的还原率增加至81％，是空白条件下还原率的1.76倍，14h时其还原率达到90％以上。六价铬还原率＝(初始六价铬浓度－某时刻六价铬浓度)/初始六价铬浓度×100％)。同时，优化条件下的蜡状芽孢杆菌生长情况较好，实验过程中肉眼可见细菌密度明显增大。
[0072] 实施例2
[0073] 选取不同形态氮肥、磷肥和钾肥，分别以低、中、高浓度投加到预培养后的李氏禾中，控制环境温度32℃，用浓度为0.1mmol/LNaOH或0.1mmol/L HCl将营养液的pH控制在7.3、溶液溶解氧DO为4mg/L，将预培养后的李氏禾移入Cr(VI)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度为0.1g/L的塑料烧杯中，蜡状芽孢杆菌在液体LB培养基中扩大培养至对数生长期，李氏禾根部避光，三组重复，检验外源营养物质对体系的影响，每个重复放置20株的李氏禾，确保实验过程中其他条件均一致。外源物质投加形态及浓度如下表所示：
[0074] 表3外源营养物质形态及浓度
[0075]
[0076]
[0077] 实验过程中每隔2h取样，对不同浓度和形态的氮、磷、钾肥进行前、中、后期的对比分析，这样能更好地比较氮磷钾肥的影响效果，选取最适宜浓度和最有助于体系还原Cr(Ⅵ)的化合物形态。
[0078] 结果如图2～13所示，对李氏禾‑蜡状芽孢杆菌体系投加不同浓度、不同形态的氮肥，分别在第4h(初期)、12h(中期)和20h(后期)测溶液中Cr(Ⅵ)浓度，其中，20mg/L的(NH4)2SO4处理效果最佳，初期还原率达到53.2％，第12h时就能将溶液中的Cr(Ⅵ)全部还原；其次是CO(NH2)2、Ca(NO3)2处理浓度保持在60mg/l的情况下，12h时的处理率分别达到87％和
85％。三种不同磷肥都是在低浓度(10mg/L)情况下，对李氏禾‑蜡状芽胞杆菌体系的促进效果更强，其中10mg/L的(NH4)2HPO4的作用效果高于其他两种磷肥，初期还原率达到65.4％，后期率先将Cr(Ⅵ)完全还原，各阶段还原率明显高于其他对照组，Ca(H2PO4)2和KH2PO4的作用程度相近，高浓度情况下反而不利于植物生长和六价铬还原。在植物‑微生物作用体系还原Cr(Ⅵ)的过程中，投加K2SO4、KCl、K2CO3三种形态不同浓度的钾肥的还原效果相近，50mg/l的K2CO3作用时各阶段还原率略高于其他对照组，可见，对于水培处理李氏禾‑蜡状芽孢杆菌体系来说，添加钾肥对体系还原六价铬的影响效果不明显。总的来说，李氏禾‑蜡状芽孢杆菌共同作用还原水体中Cr(Ⅵ)时，单独添加20mg/l的(NH4)2SO4、10mg/l的(NH4)2HPO4、
50mg/l的K2CO3分别作用时，还原效率高于同种有机肥的其他形态和浓度，过量有机肥及不合理使用，易导致添加营养物质的利用率降低，植物修复效率下降，致使修复成本增加；投加有机肥的溶液中蜡状芽孢杆菌的细菌光密度值普遍偏低，但是与空白组相比，投加氮磷钾肥仍然对细菌本身产生了促进作用，只是与其他环境影响因子相比，添加不同形态、浓度的肥料对蜡状芽孢杆菌的生长影响甚微
[0079] 对比试验
[0080] 选取生长一致的李氏禾，根部灭菌后用Hoagland完全营养液+抗生素(青霉素、链霉素混合液)中温室培养15d后，再以浓度为10mg/L的Cr(Ⅵ)胁迫处理，继续培养10天后将李氏禾从基质中取出，为保证实验过程中根系分泌物成分不变，取培养李氏禾的原水培液(作为根系分泌物)，置于锥形瓶中进行实验。设五组对照处理：空白对照、活菌、根分泌物、根分泌物+活菌、根分泌物+灭活菌，细菌浓度0.1g/L，灭活菌采用扩大培养后的蜡状芽胞杆菌经高压蒸汽120℃，灭活20min；溶液总体积300mL，放入摇床培养，控制培养条件为30℃、160rmp，对锥形瓶中溶液不同时段(2、4、6、8……36h)取样。测定铬还原率。
[0081] 不同时间段溶液中Cr(Ⅵ)的浓度采用二苯碳酰二肼分光光度法测，使溶液保持酸性，Cr(Ⅵ)与二苯碳酰二肼反应生成紫红色化合物，于波长540nm处进行分光光度测定得到Cr(Ⅵ)的浓度，绘Cr(Ⅵ)还原率柱状图。实验中含有蜡状芽胞杆菌作用的的三组(活菌、根分泌物+活菌、根分泌物+灭活菌)同时测细菌溶液在波长600nm处的吸光度，利用细菌的吸光值来反应细菌菌体细胞密度，从而了解细菌的生长情况，绘制细菌生长曲线。六价铬还原率＝(初始六价铬浓度－某时刻六价铬浓度)/初始六价铬浓度×100％，实验数据用SPSS软件进行统计分析。
[0082] 结果如图14所示，李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌共同作用时，还原处理效果高于空白组和单一物质作用的情况，与此同时，蜡状芽孢杆菌生长情况也较好，说明李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌的生长具有一定的相互促进作用。在30℃条件下，根分泌物与活菌共同作用对六价铬的还原效果最为明显，第12h还原率达到93％，在24h内几乎将溶液中的Cr(Ⅵ)全部还原；根分泌物与灭活菌共同作用，在第8h时，六价铬的还原率突然增加了40％，且作用效果明显，22h时趋于稳定，去除率达到88％；蜡状芽孢杆菌单独作用时相对于根分泌物与活菌共同作用情况下，还原效果明显降低，第10h还原率达到34％，最高还原率为58％；根分泌物单独作用情况下，Cr(Ⅵ)还原率维持在23％左右；空白对照组随时间变化几乎没有还原作用。第10h时，根分泌物与活菌共同作用时的还原率可达到蜡状芽胞杆菌单独作用的两倍。通过短期实验研究，加入适量浓度的蜡状芽孢杆菌，与李氏禾根际分泌物共同作用，对水体中Cr(Ⅵ)的还原作用效果明显增强。
[0083] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
