[0003] 本发明的目的在于提供一种利用复合菌剂制备絮凝剂的方法。假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP协同发酵得到的胞外多糖制备得到的絮凝剂脱色絮凝效果好，对生物体无潜在毒性，绿色健康；在发酵期间菌种附着在载体上，可轻松分离，且发酵期间以农作物废弃物水解液为碳源，絮凝剂制备成本低。
[0004] 本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP协同发酵得到的胞外多糖制得絮凝剂。其中，假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18的分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12913。交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP的分类命名为交替假单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12914。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述两株海洋细菌均从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得。
[0005] 海洋菌株GHS18的16S rDNA全基因（1277 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702262。其全序列如下：
[0006] ATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTATCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC。
[0007] 海洋菌株JP的16S rDNA全基因（1279 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702268。其全序列如下：
[0008] AATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAACCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCC。
[0009] 利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，包括种子液培养、液体培养基的制备、扩大发酵培养、絮凝剂的制备。其中，液体培养基的成分为：农作物废弃物水解液150-250ml/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。农作物废弃物水解液代替葡萄糖为海洋假交替单胞菌提供碳源，大幅降低了培养基的制备成本。在发酵培养期间，本发明的海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖。
[0010] 作为优选，农作物废弃物水解液的制备方法为：将农作物废弃物切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:4-10加入0.7-2.5%硫酸水解，水解温度为105-121℃，水解时间为1-4h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为农作物废弃物水解液。无机酸将分子量大的纤维素水解成小分子糖，使得海洋假交替单胞菌可轻松将其作为碳源进行利用。以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本；农作物废弃物为禾本科植物秸秆。
[0011] 作为优选，种子液培养步骤为将假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18接种于斜面培养基，于22-27℃恒温培养24-72h后，加入培养基体积0.7-1.3倍的无菌水，振荡制得种子液一；将菌种换成交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP，重复上述步骤，得到种子液二，将种子液一和种子液二按质量比为0.8-3.0：0.8-3.0混合得到种子液三。上述种子液的培养可将本发明海洋细菌从保藏状态恢复到新陈代谢旺盛的状态，生长繁殖速度快，得到数量充足的菌种。
[0012] 作为优选，扩大发酵培养步骤为每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液和6-9g载体，于22-27℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为100-140r/min，发酵培养时间为24-
72h；载体为沙土，沙土重量比组成为60-90%沙和10-40%土。在发酵培养期间，海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；胞外多糖具有优异的脱色絮凝效果。
[0013] 作为优选，絮凝剂的制备步骤为将发酵液静置或低速离心，取下层固体，喷雾干燥或冷冻干燥得到絮凝剂。海洋细菌附着在沙土上生长繁殖，并随沙土一起沉降，同时菌种的代谢产物---胞外多糖可以一并获取。上述絮凝剂有效成分分离操作简单，无需醇沉操作，降低人工成本和材料成本。絮凝剂用量少，脱色率高，形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。
[0014] 作为优选，斜面培养基成分为：葡萄糖15-25g/L、尿素0.44-0.52g/L、硫酸铵0.19-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L、琼脂12-17g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-35min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠
0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，胞外多糖产量提高。
[0015] 作为优选，沙土优选菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土。菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0017] 1.以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本；
[0018] 2. 沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高；
[0019] 3. 假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP之间的生长繁殖有明显的协同作用，制备得到的絮凝剂脱色絮凝效果均优于单一菌种发酵得到的絮凝剂，具有明显进步；
[0020] 4. 絮凝剂用量少，脱色率高，对高岭土的絮凝率达到92％以上；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达95％以上、99.6％以上和99％以上；形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。
