[0026] 下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0027] （1）试验设置7个施氮水平（0、3 、6 、9、12、18和24 kg/667m2）7个处理，重复32 2
次，小区面积24m，随机区组排列，其中9 kg/667m为发达国家马铃薯生产上建议施氮水平。
[0028] 所有小区于出苗后70天进行收获，测定和计算小区产量、单株结薯数等。
[0029] 在马铃薯的块茎膨大期，每小区随机测定10株马铃薯植株第四片叶（完全展开叶）的顶小叶SPAD值和净光合速率，每小区随机选取马铃薯植株第四片叶（完全展开叶）的顶小叶10片，液氮保存带回实验室，采用Trizol 试剂盒提取总RNA，测定RNA浓度，各RNA样品稀释同一浓度0.2µg/µl。
[0030] （2）根据GenBank中马铃薯Actin与NR基因序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，NR基因（基因登录号GenBank: U76701.1）引物序列为：
[0031] 正向引物：5'- TGGACATATCTATGATGCCTCACG-3'（SEQ ID NO.1），[0032] 反向引物：5'- AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA-3'（SEQ ID NO.2）；
[0033] 肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在最保守的古老蛋白质之一。在所有细胞中均有表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，基因表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小,因而本发明采用肌动蛋白基因作为内参基因,以提高准确性和可靠性。
[0034] Actin基因引物序列如下：
[0035] 正向引物：5'- AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA-3'（SEQ ID NO.3），
[0036] 反向引物：5'- CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG -3'（SEQ ID NO.4）。
[0037] 引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0038] （3）用上述引物分别对提取的总RNA进行real time RT-PCR扩增。
[0039] 第一步是反转录，
[0040] 先配制RNA和反转录引物混合物（5μl）：RNA 2μl、 [Oligo(dT)15 引物 0.5 μl（浓度为10µ/M）、随机引物 (浓度为10µ/M) 0.5μl、超纯水补至5μl。混合物70℃变性5分钟，4℃冷却5分钟；
[0041] 随后配置反转录反应液（5μl），5×反应缓冲液2 μl， 25mM MgCl2溶液 1μl、10mM dNTPs 0.5μl、RNA酶抑制剂 0.25μl、反转录酶 0.5μl、超纯水补至5μl。
[0042] 将5μl反应液加入到RNA/引物混合物中，混匀，42℃延伸1小时，70℃变性15分钟。
[0043] 第二步荧光定量PCR
[0044] 20μl反应体系：2× SYBR Green Real time-PCR mix 10 μl、模板（cDNA）2 μl、正向引物和反向引物各1 μl（浓度为10µ/M）、超纯水补至所需体积。
[0045] PCR程序：95℃ 2分钟预变性后40个PCR循环参数为： 95℃ 5秒，60℃ 30秒。
[0046] 按照上述实验方法进行获得试验数据，阈值与Ct值由荧光定量PCR仪自带软件自动得出。NR基因的相对表达量ΔCt=CtNR-CtActin，ΔCt值越小，NR基因的表达量越高，ΔCt值越大，NR基因的表达量越低。
[0047] 其中：ΔCt = CtNR-CtActin，CtNR和CtActin 分别表示硝酸还原酶基因NR和内参基因肌动蛋白基因Actin在 Real time PCR扩增过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数，而阈值是在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限，Ct值越大即扩增所需的循环数越多，基因的表达量就越小，反之，基因的表达量越大；ΔCt值小于零，表示NR基因扩增所需的循环数小于Actin基因，Actin基因的CtActin比较稳定，因此，ΔCt值越小，NR基因的表达量越大，反之，表达量越小。
[0048] （4）根据各施氮处理NR基因的表达水平，通过建立拟合公式，可计算得出植株的氮素营养状况而需要添加氮肥的量，建立大田马铃薯植株氮素营养分子诊断技术的量化。
[0049] 试验结果见图1和表1，从表1中可以看出，随着施氮水平的提高，叶绿素含量呈上升的趋势；NR基因的ΔCt值随施氮水平的提高而增加，NR基因的表达量随施氮水平的提高2 2
降低。而马铃薯产量呈先上升后下降的趋势，9 kg /667m时产量最高，为1357.27 kg/667m
2
，但6-18 kg /667m各处理产量差异不显著。秋播马铃薯由于生长季节短，温度高，植株生
2
长和产量不及冬播马铃薯，因此，每亩需氮量较低，6 kg /667 m就能满足其生长，并获得
2 2
1141.25 kg/667m产量，不施氮或过低（3 kg /667m ），植株生长不良，叶绿素合成收到影
2
响，叶色偏淡，产量显著降低；施氮过高产量增加不显著（12，18 kg /667m）或显著降低（24
2
kg /667m），氮肥利用效率降低，造成浪费。在生产中，随着目标产量提高，植株需氮量增加，土壤中供氮减少，需要追施氮肥。由于产量最高时的施氮水平和国外发达国家马铃薯生产
2
建议的施氮水平均为9kg/667m，根据表1中的ΔCt和施肥水平拟合曲线（见图2），得到追
2 2
施氮的拟合方程1为N=-6.7891*ΔCt-37.622*ΔCt-43.033（R=0.9895），根据叶绿素含量
2
SPAD值和施肥水平拟合曲线（见图3），得到追施氮的拟合方程2为N=-0.0887*SPAD-5.78
2 2
19*SPAD-85.518（R=0.9575），可见ΔCt的拟合度R大于SPAD的拟合度，说明NR基因的表达更能直接反映植株氮素营养状况和土壤供氮状况，根据拟合方程1和ΔCt值，求得施
2
氮量N（纯氮 kg/667m），当N大于零时，需追施氮肥，当N小于零时，不用追施氮肥。因此，硝酸还原酶基因(NR)作为衡量马铃薯植株氮素营养状况的分子标记，采取Real time PCR检测植株氮素营养具有判断准确性好、灵敏度高等优点。
[0050] 表1 不同施氮水平对秋马铃薯叶绿素含量、NR基因表达量及产量的影响[0051]
[0052] 表内平均数经Ducan氏多重极差测验，小写字母表示5%水平，大写字母表示1%水平。
