[0005] 本发明的目的在于提供一种操作简单，制备的脱色絮凝剂脱色率高，性能稳定，絮凝效果好的脱色絮凝剂制法。
[0006] 本发明针对背景技术提到的问题，采用的技术方案为：一株需氧活性海洋细菌JP是从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离获得，该菌株合适的生长盐度范围为1%-15%。依据《Bergy’s manual of systematical bacteriology》(Brenner, D.J., Krieg, N.R., Staley, J.T. &Garrity, G.M. (eds., 2005),2nd ed., vol. 2, Springer-Verlag, New York, NY.)，鉴定为Pseudoalteromonas sp，即交替假单胞菌，具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas undina）。已于2016年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 12914。
[0007] 海洋菌株JP的16S rDNA全基因（1279 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702268。其全序列如下：
[0008] AATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAACCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCC。
[0009] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。
[0010] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：
[0011] 种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，恒温培养后，培养温度为22-27℃，培养时间为24-72h。加入无菌水，培养基与无菌水体积比为1:0.7-1.3，振荡制得种子液。上述种子液的培养可将菌种从保藏状态恢复到活力旺盛的生长繁殖状态，并且能得到数量充足的菌种；
[0012] 扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液，恒温摇床培养。发酵温度为22-27℃，摇床速率为120-140r/min，发酵培养时间为3-4d。在发酵培养期间，菌种利用培养基中的营养成分进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；
[0013] 胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入乙醇，乙醇体积为上清液体积的3-6倍。在2-5℃下静置10-18h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。亲水的多糖的水化层被乙醇破坏，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式与其他成分分离，同时多糖的活性不会被破坏；
[0014] 精制：在胞外多糖粗制品中加水，粗制品体积为水的1-2倍。振荡后加入乙醇，乙醇体积为水溶液体积的3-6倍，乙醇温度为2-5℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。
[0015] 作为优选，斜面培养基成分及其浓度为：葡萄糖10-25g/L、尿素0.43-0.52g/L、硫酸铵0.18-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.25-5 g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L、琼脂12-16g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，110-120℃高压灭菌26-33min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量。斜面培养基去除琼脂即为液体发酵培养基。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，降低产品成本。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离纯化并筛选出一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp），并提取胞外多糖制得脱色絮凝剂。本发明制备的脱色絮凝剂脱色效果很好，对高岭土的絮凝率达到90％以上；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达92％以上、99％以上和98％以上；絮凝剂性质稳定，制备步骤简单，原料成本低廉，经济效益高，可大规模生产。具体实施例
[0017] 下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
[0018] 实施例1：
[0019] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp），具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas undina），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12914。
[0020] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。
[0021] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：
[0022] 1）种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，于25℃恒温培养36h。加入等体积无菌水，振荡制得种子液。上述种子液的培养可将菌种从保藏状态恢复到活力旺盛的生长繁殖状态，并且能得到数量充足的菌种；
[0023] 2）扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液，于25℃恒温摇床培养3.5d，摇床速率为130r/min。在发酵培养期间，菌种利用培养基中的营养成分进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；
[0024] 3）胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入5倍体积的乙醇。在4℃下静置16h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。亲水的多糖的水化层被乙醇破坏，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式与其他成分分离，同时多糖的活性不会被破坏；
[0025] 4）精制：在胞外多糖粗制品中加等体积水，振荡溶解完全后加入5倍体积乙醇，乙醇温度为4℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。
[0026] 斜面培养基成分及其浓度为：培养基成分及其浓度为葡萄糖18g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾3.6g/L、磷酸二氢钾1.6g/L、琼脂15g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝
0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量。斜面培养基去除琼脂即为液体发酵培养基。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，降低产品成本。
[0027] 实施例2：
[0028] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp），具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas undina），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12914。
[0029] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。
[0030] 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：
[0031] 1）种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，于25℃恒温培养36h。加入1.2倍体积无菌水，振荡制得种子液。斜面培养基成分及其浓度为：葡萄糖20g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.45g/L、磷酸氢二钾2.8g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、琼脂14g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸
0.002 g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量；
[0032] 2）扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液，于25℃恒温摇床培养3d，摇床速率为130r/min。液体发酵培养基葡萄糖20g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.45g/L、磷酸氢二钾2.8g/L、磷酸二氢钾1.3g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量；
[0033] 3）胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入5.3倍体积的乙醇。在4℃下静置14h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品；
[0034] 4）精制：在胞外多糖粗制品中加1.2倍体积水，振荡溶解完全后加入5.3倍体积乙醇，乙醇温度为4℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。
[0035] 实施例3：絮凝活性的测定
[0036] 采用对高岭土悬浊液的絮凝活性测试法 (R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screening and Characteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986 ：2301-2307)取5g/L的高岭土悬浊液93ml，加入5ml 1％(m/v)CaCl2做助凝剂，加入 2ml 实施例2样品，调节 pH 值为 9，混合快速搅拌 1min，再慢速搅拌 5min，静置
10min，取水平面下 1cm 处混合液，可见分光光度计测 550nm 下吸光度 A，同时以 2ml 蒸馏水代替样品作为对照，测吸光度 B，计算絮凝率，FR(％ ) ＝ (A-B)/A×100％。则海洋细菌脱色絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为 91.34％。
[0037] 实施例4：脱色活性测定
[0038] 取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中，加入 1ml 浓度为 2g/L 的实施例2样品，漩涡振荡 1min，调节溶液 pH 值为9，静置 30min 后取水平面下 1cm 处溶液，测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度，计算脱色率，DR(％) ＝ (A-A 0)/A×100％。则海洋细菌脱色絮凝剂对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为 92.13％、99.35％和 98.44％。
[0039] 实施例5：活性污泥性能改善实验
[0040] 在新鲜活性污泥中加入实施例2样品，投加量为 2g/L，搅拌均匀，适量曝气，2天后测 SV 30 、SVI，并做活性污泥压片显微观察污泥中微生物种类。实验结果表明 SV 30 、SVI分别由原活性污泥的390、80.42降至340、74.13，说明活性污泥沉降性能有了一定的提高。显微观察表明絮凝培养后菌胶团结构变得更紧密、丝状菌相对减少、出现了能显示良好水质的指示生物-轮虫等原生动物，表明该微生物絮凝剂的投加对活性污泥起到了良好的改善性能及结构的作用。
[0041] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
[0042] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
